偷窥国产在线91,亚洲无线国产观看原创,日本精品aⅴ一区二区三区,久久九九兔免费精品6

簡介：復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文伴有血管性因素的輕度認(rèn)知障礙患者的神經(jīng)心理學(xué)特點姓名楊佳申請學(xué)位級別碩士專業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師洪震20060301復(fù)旦大學(xué)碩士研究生論文伴有血管性因素的輕度認(rèn)知障礙患者神經(jīng)心理學(xué)特點摘要目的橫向及縱向研究伴有血管性因素的輕度認(rèn)知障礙患者的神經(jīng)心理學(xué)特點。對象與方法241例認(rèn)知評定，其中VMCL51例，NMCL51例，VAD42例，及正常對照97例。VMCI患者分別同VAD患者、礎(chǔ)CI患者及正常對照組進行認(rèn)知功能比較。認(rèn)知評定工具聽覺詞語學(xué)習(xí)測驗、數(shù)字符號轉(zhuǎn)換測驗、STOOP色詞測驗、連線測驗、言語流暢性測驗、REYOSTERRIETH復(fù)雜圖片測驗、搜鐘測驗及BOSTON命名測驗。結(jié)果1VMCI患者的聽覺詞語學(xué)習(xí)測驗中三項即刻回憶、短時與長時延遲回憶，復(fù)雜圖形測驗中的延遲回憶部分，數(shù)字符號轉(zhuǎn)換測驗中的正確數(shù)，連線測驗A和B的耗時數(shù)，STROOP色詞測驗中卡片A、B和卡片C的耗時數(shù)，卡片B和卡片C的正確數(shù)，連線測驗中的TMTBTMTA差值以及STROOP色詞測驗SIE耗時數(shù)與正確數(shù)，言語流暢性測驗中蔬菜、水果及動物數(shù)，REYOSTERRIETH復(fù)雜圖片臨摹測驗中的得分，搜鐘測驗中搜鐘數(shù)均明顯低于正常對照組，且均有統(tǒng)計學(xué)意義，尤其是AVMT3、AVMT4、AVMT6、AVMT7的得分均值小于正常對照組的得分均值一1SD，AVMT5的得分均值小于正常對照組的得分均值2SD與VMCI病例組相比，VAD患者在聽覺詞語學(xué)習(xí)測驗中的即刻回憶AVMTL～AVMT3、延遲回憶AVMT4、AVMT5、線索回憶AVMT6、再認(rèn)AVMT7及反映學(xué)習(xí)能力的AVMT3一AVMTL中的得分，REYOSTERRIETH復(fù)雜圖形回憶測驗得分，連線測驗A和B的耗時數(shù)，TMTBTMTA，數(shù)字符號轉(zhuǎn)換測驗得分，STROOP色詞測驗中卡片A、B的耗時數(shù)，卡片A、B和C的正確數(shù)，反應(yīng)抗干擾能力的指標(biāo)SIE正確數(shù)，言語流暢性測驗中蔬菜、水果及動物數(shù)得分，BOSTON命名測驗中的自發(fā)命名、提示命名和選擇命名得分，搜鐘測驗中搜鐘數(shù)均較VMCI患者低，以上這些差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。而在REYOSTERRIETH復(fù)雜圖片臨摹測驗兩組病例無明顯差異。2VMCI病例組在數(shù)字符號轉(zhuǎn)換測驗、STROOP色詞測驗中卡片A、B的耗時數(shù)、REYOSTERRIETH復(fù)雜圖形L臨摹測驗、搜鐘測驗中搜鐘耗時數(shù)較NMCI病例組得分均顯著降低；相對于VMCI患者，NMCI病例組在聽覺詞語測驗即刻回憶AVMTL～AVMT3、延遲回憶AVMT4、AVMT5、線索回憶AVMT6、再認(rèn)AVMT7及反映學(xué)習(xí)能力的AVMT3一AVMTL中的得分均較低，尤其是延遲回憶、線索回憶及再認(rèn)中的得分顯著降低，均有顯著差異。結(jié)論與正常對照組比較，VMCI患者除了存在詞語學(xué)習(xí)能力、言語記憶、情景

簡介：研究背景巨細(xì)胞病毒CYTOMEGALOVIRUS，CMV屬Β皰疹病毒亞科，其中感染人類的是人巨細(xì)胞病毒HUMANCYTOMEGALOVIRUS，HCMV，在人群中普遍感染。人群感染HCMV后通常呈潛伏感染，對健康人體并沒有明顯短期危害，但對免疫功能低下的個體，如艾滋病患者、器官移植患者、干細(xì)胞治療患者、腫瘤患者及使用免疫抑制劑的患者可造成致死性損傷1。對嬰幼兒而言，HCMV是最常見的先天性感染病毒，是引起人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的主要病原之一，可導(dǎo)致胎兒畸形及遲發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等24。此外HCMV長期反復(fù)激活感染也引發(fā)一些慢性疾病，如動脈粥樣硬化等56?，F(xiàn)代病毒學(xué)認(rèn)為程序性細(xì)胞死亡即是病毒感染導(dǎo)致機體損傷機制又是宿主本身一種抗病毒機制，宿主可通過程序性細(xì)胞死亡可以清除病毒感染的細(xì)胞，抑制病毒復(fù)制。很多針對病毒感染的治療，包括化療以及免疫治療均通過誘導(dǎo)病毒感染的細(xì)胞死亡而實現(xiàn)。程序性細(xì)胞死亡主要分為兩種，Ⅰ型為細(xì)胞凋亡APOPTOSIS，Ⅱ型是自噬性細(xì)胞死亡AUTOPHAGY。過去關(guān)于細(xì)胞凋亡機制和信號傳遞的研究幫助我們對病毒感染致病的生物學(xué)特性有了一定的了解，并且在治療新策略方面為我們提供了一些潛在的分子靶點。相反，其它形式的程序性細(xì)胞死亡在病毒致病性中的作用卻研究較少。研究目的在此項研究中，我們將著力于掌握細(xì)胞自噬及其MT信號通路在HCMV感染過程中的作用。本項目研究的具體目的如下1掌握HCMV感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬及其MT信號通路表達(dá)變化2掌握細(xì)胞自噬及其MT信號通路在HCMV感染復(fù)制過程中的作用及其機制。研究方法1檢測HCMV感染不同時期誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬狀態(tài)以及MT信號通路關(guān)鍵分子及其下游蛋白的表達(dá)水平將HCMV以MOI為1接種HELF細(xì)胞（人胚肺成纖維細(xì)胞），設(shè)立滅活病毒對照組，作用1H、2H、4H、8H、24H、2D、4D、8D后分別作如下檢測11自噬通過以下方法檢測電子顯微鏡檢測自噬性細(xì)胞死亡形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)、吖啶橙細(xì)胞染色熒光顯微鏡檢測細(xì)胞自噬、流式細(xì)胞儀定量檢測吖啶橙熒光顆粒陽性細(xì)胞數(shù)、構(gòu)建自噬標(biāo)記物PGFPLC3轉(zhuǎn)染HELF細(xì)胞，經(jīng)不同組HCMV感染后激光共聚焦顯微鏡檢測自噬激活、WESTERN檢測自噬標(biāo)記物L(fēng)C3表達(dá)。12MT信號通路關(guān)鍵分子表達(dá)水平檢測WESTERNBLOT檢測各組細(xì)胞MT信號通路關(guān)鍵分子PP70S6K磷酸化的P70S6K、P4EBP1（磷酸化的4EBP1）表達(dá)水平。2通過對使用自噬抑制劑、促進劑作用后不同時間點的病毒感染、復(fù)制、釋放動力學(xué)檢測，判斷宿主細(xì)胞自噬狀態(tài)對病毒增殖復(fù)制過程中的影響。事先分別用自噬抑制劑3MA及自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素用于HELF細(xì)胞，然后將HCMV以MOI為1分別接種HELF細(xì)胞（人胚肺成纖維細(xì)胞），設(shè)立滅活病毒對照組，作用12H、24H、36H、48H、60H。21病毒增殖動力學(xué)檢測收集細(xì)胞培養(yǎng)物和上清，凍融三次后，空斑實驗檢測病毒滴度。22病毒特異性蛋白表達(dá)檢測采用免疫印跡實驗檢測不同時間點病毒特異性蛋白表達(dá)變化。23病毒基因拷貝數(shù)檢測熒光定量PCR檢測。3建立巨細(xì)胞病毒感染動物模型技術(shù)，在體實驗驗證巨細(xì)胞病毒感染導(dǎo)致宿主細(xì)胞自噬狀態(tài)改變。BALBC小鼠經(jīng)腹腔接種小鼠巨細(xì)胞病毒MCMV，建立小鼠巨細(xì)胞病毒感染小鼠模型，通過病毒分離、免疫熒光和PCR技術(shù)檢測模型小鼠感染狀態(tài)，通過WESTERNBLOT檢測細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表達(dá)水平和透射電鏡檢測檢測模型小鼠肺組織細(xì)胞自噬。研究結(jié)果1吖啶橙染色、轉(zhuǎn)染GFPLC3熒光顯微鏡觀察和透射電鏡觀察結(jié)果表明HCMV感染12H可明顯促進HELF細(xì)胞自噬，HCMV感染36H后轉(zhuǎn)變?yōu)橐种艸ELF細(xì)胞自噬。免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)HCMV感染12H抑制MT自噬信號通路下游關(guān)鍵分子表達(dá)，感染36H后轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠MMT信號通路下游關(guān)鍵分子表達(dá)。2自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素組HCMVAD169株病毒DNA拷貝數(shù)、HCMVPP65蛋白表達(dá)量及病毒滴度均較正常對照組高，而自噬抑制劑3MA組HCMVAD169株病毒DNA拷貝數(shù)、HCMVPP65蛋白表達(dá)量及病毒滴度均較正常對照組低。3在建立MCMV急性感染小鼠肺組織模型基礎(chǔ)上，透射電鏡檢測結(jié)果顯示，MCMV感染組小鼠肺組織可看見明顯細(xì)胞自噬改變WESTERN檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，MCMV感染組LC3Ⅱ表達(dá)上調(diào)，結(jié)果表明MCMV急性感染促進小鼠肺組織細(xì)胞自噬。結(jié)論1本研究發(fā)現(xiàn)HCMV感染早期促進宿主細(xì)胞自噬，感染晚期變?yōu)橐种扑拗骷?xì)胞自噬，而MT自噬信號通路參與其中。2本研究分別從分子、蛋白和細(xì)胞水平證實了促進宿主細(xì)胞自噬可從一定程度上促進HCMV增殖，抑制宿主細(xì)胞自噬可從一定程度上抑制HCMV增殖。3MCMV急性感染促進小鼠肺組織細(xì)胞自噬。

簡介：河批運斜太蠆臨床醫(yī)學(xué)博士專業(yè)學(xué)位論文不同類型癲癇發(fā)作對大鼠認(rèn)知功能的影響及機制初探中請人姓名導(dǎo)師專業(yè)二級學(xué)院研究起止日期交稿日期婁燕王維平教授神經(jīng)病學(xué)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院2003年9月一2006年4月2006年4月中文摘要方法107只體重20020G健康雄性成年SPRAGUEDAWLEYSD大鼠隨機分為癲癇持續(xù)狀態(tài)STATUSEPILEPTICUS，SE組、SE對照組CONTROLI、慢性癲癇CHRONICEPILEPSYCEP組、CEP對照組CONTROLII1和非驚厥性失神發(fā)作癲癇持續(xù)狀態(tài)GENERALIZEDNONCONVULSIVESTATUSEPILEPTICUS，GNCSE組及GNCSE對照組CONTROLIII6組。制模過程中出現(xiàn)死亡或因不符合模型標(biāo)準(zhǔn)的均及時剔除，然后隨機補充，保證每組動物15只。各處理組均用生理鹽水溶解的L％的PTZ溶液，按不同的方法制各成不同的動物模型。SE組是將PTZ按40MG／KG腹腔注射，10分鐘后注射20MG／KG，然后每LO分鐘注射10MG／KG，直至誘發(fā)大鼠急性SE發(fā)作持續(xù)30分鐘以上，誘發(fā)成功的大鼠均達(dá)RACINE標(biāo)準(zhǔn)5級。CEP組是將PTZ按35MG／KG腹腔注射每48小時注射一次，每次注射后觀察大鼠20分鐘，并記錄它們的行為。一般需要至少15～22次注射即可獲得完全點燃。完全點燃的標(biāo)志是在連續(xù)三次的PTZ注射期間均有RACINE4～5級的驚厥發(fā)作。GNCSE組是按最初劑量為PTZ25MG／KG腹腔注射，然后連續(xù)每LO分鐘追加注射10MG／KG，直到重復(fù)的失神發(fā)作達(dá)30分鐘以上。相應(yīng)的對照組按相應(yīng)處理組的方法腹腔注射相同次數(shù)、同等容量的生理鹽水。同時選擇不同的處理組大鼠2～3只進行EEG描記。結(jié)果SE組大鼠應(yīng)用PTZ約5～20分鐘大鼠開始出現(xiàn)肌陣攣，隨著PTZ注射次數(shù)的增加，很快出現(xiàn)四肢抽搐，有的伴有翻滾并進入全面性強直收縮階段，強直階段過后出現(xiàn)全面性強直一陣攣驚厥。大鼠SE持續(xù)時間在3060MIN。CEP組大鼠按RACINE分級標(biāo)準(zhǔn)。大鼠于6～8次注射后出現(xiàn)II～Ⅲ級發(fā)作，隨著注射次數(shù)的增加，發(fā)作逐日加重，完全點燃的大鼠經(jīng)過連續(xù)3次的PTZ注射，驚厥發(fā)作均達(dá)RACINE1V以上的點燃標(biāo)準(zhǔn)。GNCSE組大鼠最初注射單次劑量的PTZ25MG／KG誘導(dǎo)個別的、孤立的失神發(fā)作。隨著注射次數(shù)的增加，出現(xiàn)短暫的、間斷性的不動伴有面部自動癥，20分鐘后逐漸頻繁出現(xiàn)，表現(xiàn)為凝視、蹲伏不動、面部微顫、觸須抖動等持續(xù)至少30分鐘構(gòu)成了GNCSE。各相應(yīng)對照組，無1例出現(xiàn)驚厥發(fā)作。EEG結(jié)果SE組顯示明顯癇性放電，為高幅多棘、多尖、尖慢綜合波。CEP組顯示在低幅的9～11HZQ背景節(jié)律下，陣發(fā)出現(xiàn)高幅多棘波。GNCSE組顯示陣發(fā)性的4QSHZ高輻棘波發(fā)放。正常對照組EEG無異常。結(jié)論本實驗應(yīng)用PTZ點燃的三種不同類型癲癇發(fā)作大鼠模型，其

簡介：點擊查看更多顯性負(fù)性突變體融合蛋白PreS2-TLM-ScFV-HBcDN抑制乙肝病毒復(fù)制的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的觀察肝炎病毒標(biāo)志物在組織原位與血清學(xué)檢測的差異比較不同類型病毒感染組病例的炎癥、纖維化程度及部分病理形態(tài)特征的差異觀察不同炎癥及纖維化程度病例及二次肝穿刺組織中COLⅠ、COLⅢ、ΑSMA和TGFΒ表達(dá)的變化認(rèn)識和探討慢性肝炎部分形態(tài)學(xué)特征膠原沉積、ΑSMA和TGFΒ表達(dá)在肝纖維化病變中的意義結(jié)論（1）慢性肝炎肝組織中肝纖維化程度常隨著炎癥程度的加劇而增加兩者關(guān)系密切（2）肝組織原位檢測HCV抗原（CP10）的陽性率達(dá)215﹪說明HCV感染在中國并不少見且多數(shù)合并有HBV感染（3）HCV感染引起的肝組織炎癥、纖維化程度及肝組織瘀膽程度均較重合并HBV感染組病例其炎癥、纖維化及肝組織淤膽比HCV單獨感染組輕（4）肝組織中COLⅠ、COLⅢ和ΑSMA表達(dá)與肝纖維化組織的炎癥分級和纖維化分期呈正相關(guān)TGFΒ沉積與纖維化程度關(guān)系更為密切而ΑSMA、TGFΒ與炎癥程度的關(guān)系更為密切（6）半定量計分系統(tǒng)對判斷和分析炎癥及纖維化程度改變的敏感性更高

簡介：目的探討TOLL樣受體2和4TLR2和TLR4在Α干擾素IFNΑ抗病毒效應(yīng)中的作用以及抗病毒蛋白25OAS和PKR在體外對抗HBV活性的研究。方法以人肝胚瘤細(xì)胞HEPG2為細(xì)胞模型通過LPS刺激并聯(lián)合IFNΑ處理細(xì)胞以RTPCR法檢測細(xì)胞表面TLR2和TLR4的表達(dá)再以WESTERNBLOT和RTPCR檢測HEPG2細(xì)胞中IFNΑJAKSTAT途徑分子STAT1、STAT2和IRF9的表達(dá)進一步分析IFNΑ誘導(dǎo)的MXA、25OAS、PKR等抗病毒蛋白的表達(dá)。以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV全基因組并能分泌完整HBV病毒顆粒子的肝胚瘤細(xì)胞株HEPG2215細(xì)胞為細(xì)胞模型將未處理的HEPG2215細(xì)胞作為空白組將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PEGFP25OAS的HEPG2215細(xì)胞作為25OAS組將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PEGFPPKR的HEPG2215細(xì)胞作為PKR組將同時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PEGFP25OAS和PEGFPPKR的HEPG2215細(xì)胞的作為共轉(zhuǎn)染組。WESTERNBLOT檢測細(xì)胞內(nèi)PKR和25OAS蛋白的表達(dá)電化學(xué)發(fā)光方法檢測HEPG2215細(xì)胞分泌的HBSAG和HBEAG量熒光定量PCR法檢測上清液中HBVDNA的量。結(jié)果研究表明HEPG2細(xì)胞在LPS的刺激下細(xì)胞表面TLR2、TLR4MRNA的表達(dá)水平升高P005。HEPG2215細(xì)胞經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠表達(dá)25OAS、PKR蛋白且25OAS組和PKR組細(xì)胞上清液中HBSAG和HBEAG的量低于空白對照組P結(jié)論1HEPG2細(xì)胞表面TLR2、TLR4被LPS刺激表達(dá)后可影響細(xì)胞內(nèi)IFNΑJAKSTAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提高抗病毒蛋白PKR和25OAS的表達(dá)從而增強了IFNΑ的抗病毒效應(yīng)。2在體外抗病毒蛋白PKR和25OAS具有獨立的抗HBV活性兩者在抗病毒效應(yīng)上具有協(xié)同作用。

簡介：點擊查看更多丙型肝炎病毒相關(guān)慢性肝病與血清脂聯(lián)素水平的關(guān)系.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：點擊查看更多長寧區(qū)社區(qū)惡性腫瘤患者生命質(zhì)量及健康認(rèn)知現(xiàn)狀研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的觀察RTPA靜脈溶栓后急性腦梗死患者3個月末的認(rèn)知功能，分析腦梗死后血管性認(rèn)知功能損害與RTPA靜脈溶栓的相關(guān)性。方法前瞻性觀察金華市中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科連續(xù)收集的首發(fā)急性腦梗死患者，根據(jù)是否接受RTPA靜脈溶栓治療分為溶栓組和非溶栓組（對照組）。比較兩組間年齡、性別、重要部位梗死（額葉、顳葉、丘腦、基底節(jié)）、教育程度、高血壓史、房顫史、收縮壓、舒張壓、C反應(yīng)蛋白、代謝障礙情況（糖尿病史、高血脂史、空腹血糖、空腹低密度脂蛋白）等基線因素，動態(tài)觀察兩組間入院24小時內(nèi)及3個月末的認(rèn)知功能，采用MMSE、MOCA評分，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件，單因素及多因素LOGISTIC回歸分析認(rèn)知功能與RTPA靜脈溶拴的相關(guān)性。結(jié)果43例患者納入本次研究，其中溶栓組為21例，對照組22例。單因素分析結(jié)果顯示溶栓組與對照組上述基線數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學(xué)差異3個月末溶栓組與對照組MOCAP＜005，P0036、MMSEP＜005，P0029評分均有差異。3個月末使用MMSE量表測定認(rèn)知功能單因素分析顯示高血壓史、年齡、C反應(yīng)蛋白、RTPA靜脈溶栓、重要部位梗死、教育程度是影響認(rèn)知功能的重要因素P＜005。多因素分析顯示年齡（0674，95％CI0410～0887，P0048）、梗死部位0355，95％CI0127～0536，P0037是血管性認(rèn)知功能損害的獨立危險因子。而RTPA靜脈溶栓（1521，95％CI1304～1780，P0041）是血管性認(rèn)知功能損害的獨立保護因子。3個月末使用MOCA量表測定認(rèn)知功能單因素分析顯示年齡、RTPA靜脈溶栓、重要部位梗死、教育程度是影響認(rèn)知功能的重要因素P＜005。多因素分析顯示年齡0536，95％CI0357～0763，P0040、重要部位梗死0262，95％CI0065～0574，P0026是血管性認(rèn)知功能損害的獨立危險因子，而RTPA靜脈溶栓1701，95％CI1461～1975，P0033、教育程度1361，95％CI1108～1635，P0042是血管性認(rèn)知功能損害的獨立保護因子。結(jié)論RTPA靜脈溶栓對腦梗死后患者認(rèn)知功能有影響，RTPA靜脈溶栓是影響腦梗死患者3個月末認(rèn)知功能的獨立保護因子。

簡介：點擊查看更多人巨細(xì)胞病毒pp65蛋白相關(guān)性研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：點擊查看更多重組腺病毒Ad-BMP-2-TNF-α-siRNA在細(xì)胞水平上生物活性的鑒定.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：研究背景乙型肝炎病毒HBV感染是一種嚴(yán)重影響人類健康的全球性疾病。它可導(dǎo)致各種急、慢性疾病，包括致命的重型肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌等。目前治療慢性乙型肝炎CHB的抗病毒藥物主要有干擾素及核苷酸類似物兩大類。核苷酸類似物進入體內(nèi)后通過競爭摻入，取代病毒復(fù)制過程中延長聚合酶鏈所需的與之結(jié)構(gòu)相似的核苷酸，由于核苷酸類似物缺乏3端羥基而不能繼續(xù)延伸DNA鏈，從而抑制病毒復(fù)制。但是由于核苷酸類似物對作為復(fù)制模板的共價閉合環(huán)狀DNACCCDNA無作用，核苷酸類似物僅能抑制HBV復(fù)制而不能完全清除HBV，因此CHB患者需要長時間服用核苷酸類似物治療以抑制病毒復(fù)制。然而長期服用核苷酸類似物有可能出現(xiàn)病毒變異而導(dǎo)致耐藥問題。其耐藥的基礎(chǔ)是復(fù)制過程中，HBV需要利用自身的DNA聚合酶將前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，由于HBV聚合酶沒有校正活性，容易出現(xiàn)錯配而導(dǎo)致突變。核苷酸類似物作用于HBV的聚合酶區(qū)，而聚合酶區(qū)基因突變可能導(dǎo)致某些特定部位的氨基酸被置換，使之與藥物的結(jié)合力下降，從而出現(xiàn)藥物敏感性降低和耐藥。拉米夫定耐藥的變異為HBVDNA聚合酶基因P區(qū)第739個核苷酸A突變?yōu)镚，使第204位的蛋氨酸被纈氨酸替代RTM204V，即YMDD突變?yōu)閅VDD，且往往同時還伴有第180位的亮氨酸被蛋氨酸所置換RTL180M的變異。核苷酸類似物耐藥為目前慢性乙型肝炎抗病毒治療中所面臨的主要難題之一，因此有必要建立核苷酸類似物耐藥模型用于抗病毒藥物的開發(fā)、篩選、耐藥機理的研究。由于HBV感染有高度的種屬和組織特異性，僅感染人和猩猩，而猩猩價格昂貴，來源困難，故動物模型缺乏。在HBV相關(guān)研究中，多使用轉(zhuǎn)基因動物模型和體外細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)基因動物模型由于動物本身的免疫狀態(tài)及遺傳背景尚不十分明確，其使用受到限制。目前體外細(xì)胞培養(yǎng)模型主要有三大類第一類是HBV直接感染細(xì)胞模型；第二類是不產(chǎn)生基因整合的瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型；第三類足HBV基因與細(xì)胞基因組基因整合并持續(xù)產(chǎn)生HBV顆粒的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。感染模型的細(xì)胞來源困難，難以長期培養(yǎng)，使用較少。瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型缺點仍為不能長期培養(yǎng)，同時受實驗條什影響大?；谀退幯芯?、藥物篩選及評價方面的考慮，細(xì)胞模型需要穩(wěn)定分泌出耐藥HBV病毒顆粒。目前國外已有構(gòu)建此類細(xì)胞株及相關(guān)的研究，但尚無公認(rèn)、廣泛使用的商品化穩(wěn)定表達(dá)耐藥HBV細(xì)胞株，因此有必要建立穩(wěn)定表達(dá)耐藥HBV體外細(xì)胞模型。將DNA有效整合入細(xì)胞基因組，其方法主要有非病毒載體法及病毒載體法。前者包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電擊穿孔法及顯微注射法等，這些方法得到穩(wěn)定細(xì)胞株的效率相當(dāng)?shù)?。后者主要是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、單純皰疹病毒載體、慢病毒載體等方法。其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及慢病毒載體對目的基因轉(zhuǎn)移效率高，容易得到穩(wěn)定表達(dá)株。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為基于逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建的病毒載體。在構(gòu)建時，刪去了POL、ENV和GAG基因，保留了5端和3端的LTR及包裝信號Ψ序列，并增加了多克隆位點、抗性標(biāo)記，與質(zhì)粒拼接而成。而病毒顆粒識別、包裝等過程所必須的GAG、POL與ENV基因整合在相應(yīng)的包裝細(xì)胞基因組內(nèi)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后，將載體DNA插入包裝細(xì)胞基因組。載體DNA轉(zhuǎn)錄出含標(biāo)記基因、目的基因、包裝信號的RNA序列，結(jié)合包裝細(xì)胞內(nèi)已提供GAG、POL與ENV蛋白，包裝出有感染能力的假病毒顆粒。這種假病毒顆?？筛腥景屑?xì)胞，并將整條病毒基因整合到宿主細(xì)胞染色體DNA上，使之成為其一部分，并能穩(wěn)定表達(dá)目的基因。研究目的構(gòu)建含RTM204V、RTL180M突變位點的拉米夫定耐藥13拷貝HBV基因及其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的方法建立表達(dá)YMDD變異HBV的穩(wěn)定細(xì)胞株，并進一步鑒定所構(gòu)建細(xì)胞株HBV復(fù)制及抗原表達(dá)情況。通過本研究探索構(gòu)建其他核苷酸類似物耐藥HBV穩(wěn)定細(xì)胞株的方法。研究方法1使用突變引物YVS、YVA對重組桿狀病毒載體上的13拷貝野生株HBV的進行RTM204V定點突變。通過突變引物526MS、526MA對目的基因進行RTL180M位點突變。PCRRFLP鑒定突變是否成功。攜帶已經(jīng)突變的目的基因的桿狀病毒重組載體瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞以測定目的基因復(fù)制活性。2攜帶13拷貝拉米夫定耐藥HBV基因的重組桿狀病毒載體質(zhì)粒與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLNCX2分別進行HINDⅢ、SALⅠ雙酶切。純化回收目的片段進行連接，獲得含反向目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PRVOYVDDHBV。通過引物HSS和HSA擴增出13拷貝拉米夫定耐藥HBV基因，并使得PCR產(chǎn)物5端帶有HINDⅢ位點，3端帶有SALⅠ位點，經(jīng)酶切、連接后獲得含正向目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PRVYVDDHBV。使用酶切、PCR及測序的方法鑒定所構(gòu)建重組載體。3重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PT67包裝細(xì)胞，含G418培養(yǎng)基壓力篩選后挑取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆，獲得含病毒培養(yǎng)上清。4倍比稀釋含重組病毒顆粒的包裝細(xì)胞培養(yǎng)上清，梯度濃度的含病毒上清感染NIH3T3細(xì)胞，含G418培養(yǎng)基壓力篩選，以確定病毒滴度。取經(jīng)感染并篩選后仍存活的NIH3T3細(xì)胞，其培養(yǎng)上清再次感染新復(fù)蘇的NIH3T3細(xì)胞，G418壓力篩選以確定有無輔助病毒存在。5含重組病毒顆粒的包裝細(xì)胞培養(yǎng)上清感染HEPG2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，挑取穩(wěn)定細(xì)胞克隆并擴大培養(yǎng)，最終獲得經(jīng)單克隆分化成長起的細(xì)胞株。ABBOTT化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀檢測HEPG2YVDDHBV培養(yǎng)上清中的HBSAG及HBEAG的表達(dá)，熒光定量法檢測上清HBVDNA，免疫組化檢測細(xì)胞內(nèi)HBCAG的表達(dá)，鑒定上清中HBV復(fù)制及抗原表達(dá)情況，測序鑒定HBV耐藥變異情況。研究結(jié)果1PCRRFLP的方法鑒定RTM204V突變成功。用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體多克隆位點兩端引物進行PCR及測序，證實定點突變成功。攜帶已經(jīng)突變的目的基因的桿狀病毒重組載體瞬時轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞，ELISA方法檢測HBSAG及HBEAG的表達(dá)均陽性。2HINDⅢ及SALⅠ雙酶切重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體多克隆位點兩端引物PCR檢測，兩種方法均證實正向插入耐藥HBV基因及反向插入耐藥HBV基因兩種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建成功。3重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞并經(jīng)過2周G418壓力篩選，得到產(chǎn)病毒包裝細(xì)胞多株。選取正向和反向插入目的基因兩實驗組細(xì)胞各一株行病毒滴度滴定。G418篩選10天后，106倍濃度稀釋上清所感染的培養(yǎng)孔則均無細(xì)胞生長，而此濃度下感染的培養(yǎng)孔內(nèi)則有細(xì)胞克隆存在，考慮病毒滴度均約在1105CFUML。經(jīng)檢測無輔助病毒存在。4含反向插入13拷貝HBV基因的重組病毒上清感染HEPG2細(xì)胞并行G418篩選，獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株常規(guī)ELISA法檢測培養(yǎng)上清中的HBSAG及HBEAG均為陰性。5含正向插入13拷貝耐藥HBV基因的病毒上清感染HEPG2細(xì)胞，共篩選出7株HBSAG及HBEAG均表達(dá)陽性的細(xì)胞克隆。挑取其中表達(dá)較高一株繼續(xù)培養(yǎng)并行進一步鑒定，命名為HEPG2YVDDHBV。同時在未突變野生株HBV病毒實驗對照組篩選出一株命名為HEPG2WHBV。6檢測HEPG2一YVDDHBV培養(yǎng)上清中的HBSAG及HBEAG的表達(dá)及HBVDNA定量，2215細(xì)胞株及未突變野生株HEPG2WHBV作為對照。結(jié)果均為陽性，但HEPG2SYVDDHBV的HBSAG、HBEAG表達(dá)及HBVDNA復(fù)制與2215細(xì)胞株相比均明顯低。持續(xù)培養(yǎng)8周HEPG2YVDDHBV細(xì)胞株培養(yǎng)上清的HBSAG、HBEAG均有持續(xù)表達(dá)。7免疫組化檢測細(xì)胞內(nèi)HBCAG的表達(dá)，結(jié)果顯示HEPG2YVDDHBV細(xì)胞內(nèi)HBCAG陽性。研究結(jié)論成功構(gòu)建了含RTM204VRTL180M位點突變的13拷貝拉米夫定耐藥HBV基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。成功將重組載體轉(zhuǎn)染PT67包裝細(xì)胞，獲得感染性重組病毒顆粒。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒找體系統(tǒng)的方法，建立了含RTM204VRTL180M變異HBV基因的穩(wěn)定細(xì)胞株HEPG2YVDDHBV。經(jīng)檢測其HBSAG及HBEAG的表達(dá)均陽性，免疫組化可檢測到細(xì)胞內(nèi)HBCAG的表達(dá)，熒光定量法檢測上清中HBVDNA為陽性。培養(yǎng)時間超過8周，HBSAG及HBEAG、HBVDNA持續(xù)陽性。測序結(jié)果顯示上清中HBV存在RTM204V及RTL180M變異，初步認(rèn)為該細(xì)胞株支持拉米夫定耐藥HBV復(fù)制及表達(dá)，但其表達(dá)復(fù)制水平較低，距實用階段尚有差距。

簡介：該論文分四部分分別對連翹抗流感病毒物質(zhì)基礎(chǔ)和黃連解毒湯有效部位的藏紅花酸分析方法進行研究第一部分連翹文獻綜述對連翹的化學(xué)成分及生物活性進行綜述共引用文獻67篇第二部分連翹的實驗研究1建立了連翹有效部位的制備方法2闡明了連翹抗流感病毒有效部位的主要化學(xué)成分3采用可見分光光度法首次對連翹抗流感病毒有效部位中總酚類成分的總量進行了測定并用從其有效部位中分離得到的具有代表性的兩個成分連翹酯苷及蘆丁進行定量分析4建立了連翹抗流感病毒有效部位中的主要指標(biāo)性成分連翹酯苷、連翹苷、蘆丁的HPLC分析方法并對樣品進行了含量測定第三部分黃連解毒湯有效部位的藏紅花酸分析方法研究第四部分對各實驗結(jié)果進行分析討論

簡介：溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文7型腺病毒溫州株基因組主要序列分析及感染性克隆構(gòu)建姓名姜招嫦申請學(xué)位級別碩士專業(yè)遺傳學(xué)指導(dǎo)教師彭穎呂建新20100501溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文6、AD7感染性克隆PMDL8TSAD7的構(gòu)建及感染性鑒定穿梭載體PMDL8TSADLADR經(jīng)PMEL線性化后與AD7WZLDNA共轉(zhuǎn)化于感受態(tài)ECOLIBJ5183中，氨卞霉素抗性平板篩選較小單菌落，挑取菌落培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒。限制性內(nèi)切酶鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。將構(gòu)建好的感染性克隆PMDL8TSAD7轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，觀察是否病變以鑒定是否具有感染性。結(jié)果L、AD的分離培養(yǎng)和基因組DNA提取、酶切鑒定病毒基因組DNA的BAMHI、H／NDIII和SINAI酶切圖譜，對照國外文獻，從BAMHI的帶型初步確定本次分離的AD病毒株為AD7D2型。2、AD7WZL基因組主要序列T克隆的構(gòu)建各重組質(zhì)粒雙酶切及ITRL、E1A261R、E1855KDA、HEXON、E3、ITRR基因測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒PMDL8TSITRL、PMDL8TSE1A26LR、PMDL8TSE1855KDA、PMDL8TSHEXON、PMDL8TSE3和PMDL8TSITRR構(gòu)建成功。3、AD7WZL基因組主要序列BLAST比對分析BLAST比對結(jié)果顯示本文得到的病毒基因組與HAD7有著最高的相似度，表明該病毒株為7型腺病毒。4、AD7WZL基因組主要序列同源性分析序列分析及BIOEDIT軟件比對結(jié)果表明其核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列與GENBANK已經(jīng)發(fā)表的AD7全基因組序列AY495969、AY601634、AY594256、AY594255、BK005235比較同源性分別達(dá)到930％100O％和980％～100O％。5、穿梭載體PMDL8TSADLADR的構(gòu)建。PMDL8TSADLADR酶切及ADL和ADR基因測序結(jié)果表明PMDL8TSADLADR穿梭載體構(gòu)建成功。6、AD7感染性克隆PMDTL8SAD7的構(gòu)建及感染性鑒定PMDL8TSAD7酶切、轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞產(chǎn)生CPE的結(jié)果表明AD7感染性克隆PMDL8TSAD7構(gòu)建成功并具有穩(wěn)定感染性。結(jié)論本實驗成功分離和鑒定了ADWZL病毒株，對AD7WZL基因組主要序列進行了分析，并成功構(gòu)建了AD7感染性克隆PMDL8TSAD7，為重組7型腺病毒載體的構(gòu)建打下基礎(chǔ)，并為進一步探討AD7感染性克隆在基因治療及疫苗研究方面提供方法。關(guān)鍵詞7型腺病毒；序列分析；感染性克隆

簡介：本文旨在了解新余市大學(xué)生乙肝病毒感染現(xiàn)況及乙肝病毒傳播的主要危險因素，研究采用現(xiàn)況調(diào)查和病例對照研究。以新余市五所民辦院校就讀了兩年的大學(xué)生作現(xiàn)況調(diào)查。然后把其中在新生入學(xué)體檢HBSAG為陰性，而就讀兩年后體檢HBSAG為陽性的237名學(xué)生作為病例組，并隨機抽取與其具有可比性的學(xué)生240人作對照組進行病例對照研究。以這477人為研究對象，對其一般人口特征、既往史、家族病史、密切接觸史等進行問卷調(diào)查。調(diào)查資料用SPSS110軟件進行統(tǒng)計分析。本次研究結(jié)果顯示日常生活接觸也是乙肝感染的主要傳播途徑。大學(xué)生是個特殊人群，處于高發(fā)年齡，并且在學(xué)校以宿舍為單位集體生活，日常生活接觸就成為大學(xué)生感染乙肝病毒的重要危險因素。所以大學(xué)院校主管部門需加強對學(xué)生的管理，并加強對學(xué)生乙肝防治知識的健康教育，提高學(xué)生對乙肝傳播途徑的知曉率，并對大學(xué)生進行乙肝疫苗的預(yù)防接種，降低大學(xué)生的乙肝感染率。