1、背景與目的：
　　肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是我國最常見的、也是發(fā)病率和死亡率最高的消化道惡性腫瘤之一，嚴重威脅人們的健康。因此，探索肝癌細胞生物學行為的發(fā)生機制，為HCC尋求有效的治療途徑十分必要。
　　大多數(shù)癌細胞內(nèi)存在著相對低氧的微環(huán)境。低氧誘導因子-2α（Hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α）是細胞氧信號途徑中的關鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，與惡性腫瘤的

2、轉(zhuǎn)歸及預后密切相關。HIF-2α在腎癌、肝癌等腫瘤中高表達，它能通過啟動其下游靶基因，而導致腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲力增強，加速疾病惡化。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下HIF-2α通過促進脂質(zhì)分化相關蛋白表達，導致人正常肝細胞株LO2細胞發(fā)生脂肪變性。然而，有關HIF-2α能否通過調(diào)控肝癌細胞脂質(zhì)代謝進而影響肝癌細胞生物學行為的研究，目前尚無報道。
　　癌細胞的低氧環(huán)境加劇細胞內(nèi)脂質(zhì)合成。硬脂酰輔酶A去和酶1（Stearoyl-C

3、oA desaturase-1,SCD1）是催化多元不飽和脂肪酸（Monounsaturated fatty acid，MUFA）合成的關鍵酶。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SCD1在肝癌中高表達，它可通過抑制腺苷酸活化蛋白激酶（ AMP-activated protein kinase，AMPK）負性調(diào)節(jié)肝癌細胞自噬以及細胞凋亡、促生存，而影響肝癌的形成及發(fā)展。但是，SCD1在肝癌細胞中表達升高的機制尚不清，低氧環(huán)境下是否通過HIF-2α介導其

4、表達，未見相關研究報道。
　　鑒于此，本研究首先觀察低氧環(huán)境下HepG2、SMMC-7721肝癌細胞株HIF-2ɑ、SCD1表達水平；在此基礎上，使用HIF-2α下調(diào)質(zhì)粒及SCD1小分子抑制劑CAY10566，探討HIF-2α是否通過調(diào)控SCD1表達，而影響肝癌細胞生物學行為，為HCC的發(fā)病機制提供新證據(jù)和潛在治療靶點。
　　方法：
　　一、低氧誘導下肝癌細胞HIF-2α和SCD1之間的調(diào)控關系：
　　1.細胞培

5、養(yǎng)：用含10％胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液分別培養(yǎng)SMMC-7721和HepG2細胞。
　　2.低氧誘導肝癌細胞HIF-2α和SCD1蛋白表達時間譜：1% O2刺激HepG2和SMMC-7721細胞0、3、6、12、24h，收集各時間點細胞并提取總蛋白，用Western blot（WB）法檢測各時間點肝癌細胞HIF-2α及SCD1蛋白表達水平。
　　3.篩選shRNA-HIF-2α質(zhì)粒

6、：設置空白、陰性質(zhì)粒、shRNA-HIF-2αA-D質(zhì)粒，按照shRNA-HIF-2α質(zhì)粒的使用說明，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72h后，用倒置熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)綠色熒光強度，用WB檢測HIF-2α蛋白表達水平，以篩選抑制效果最佳的shRNA-HIF-2α質(zhì)粒。
　　4.低氧下肝癌細胞HIF-2α和SCD1的調(diào)控關系：根據(jù)上述實驗結果，選取12h為SMMC-7721和HepG2細胞的最佳低氧誘導時間點；參照前期研究，用10μM SCD1小分子抑

7、制劑CAY10566處理肝癌細胞24h。分為以下幾組：空白組（無任何處理）、低氧組（1%O212h）、低氧陰性對照組（HIF-2α陰性質(zhì)粒+1%O212h）、低氧干擾組（HIF-2α干擾質(zhì)粒+1%O212h）、低氧CAY組（CAY1056610μM+1%O212h）、低氧干擾+CAY組（HIF-2α干擾質(zhì)粒+CAY1056610μM+1%O212 h）， WB檢測各組肝癌細胞HIF-2α及SCD1蛋白表達變化。
　　二、低氧下HI

8、F-2α—SCD1通路對HepG2和SMMC-7721細胞生物學行為的影響：
　　CCK8技術檢測各組細胞增殖情況，流式細胞術Annexin-V/PE法檢測各組細胞凋亡情況，侵襲小室實驗檢測各組細胞侵襲能力。
　　結果：
　　一、低氧誘導下肝癌細胞細胞HIF-2α和SCD1之間的調(diào)控關系
　　1、低氧誘導肝癌細胞 HIF-2α和SCD1蛋白表達時間譜：隨著低氧誘導時間延長（0h、3h、6h、12h、24h），He

9、pG2和SMMC-7721細胞HIF-2α和SCD1蛋白表達均呈時間依賴性增加(P＜0.05)。其中，SMMC-7721細胞于低氧刺激12h時，HIF-2α蛋白表達水平升高至平臺期。因此，后續(xù)實驗以12h為SMMC-7721和HepG2細胞的最佳低氧誘導時間點。
　　2、篩選shRNA-HIF-2α質(zhì)粒：在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細胞72h后，各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率達90%左右；WB結果顯示，與空白對比，shRNA-HIF-2α C質(zhì)粒抑制肝癌細胞HI

10、F-2α蛋白表達的效果最佳（P＜0.05）。
　　3、低氧下肝癌細胞HIF-2α和SCD1之間的調(diào)控關系：WB結果顯示，低氧環(huán)境下抑制HIF-2α表達后，兩種肝癌細胞表達SCD1蛋白水平均明顯降低（P＜0.05）；而抑制SCD1表達，對肝癌細胞HIF-2α蛋白表達無明顯影響（P＞0.05）；同時抑制HIF-2α和SCD1表達，肝癌細胞表達SCD1蛋白減少程度較單獨抑制HIF-2α或SCD1的更為明顯（P＜0.05）。提示低氧條件下

11、HIF-2α對肝癌細胞SCD1的表達具有一定調(diào)控作用。
　　二、低氧下HIF-2α—SCD1通路對HepG2和SMMC-7721細胞生物學行為的影響
　　1、CCK8檢測肝癌細胞增殖情況：與空白組比較，低氧組、低氧陰性組HepG2和SMMC-7721細胞增殖率升高（P＜0.05）；低氧環(huán)境下抑制HIF-2α或SCD1表達，HepG2、SMMC-7721細胞增殖率較低氧組明顯降低（P＜0.05）；同時抑制HIF-2α和SCD1

12、表達，兩種肝癌細胞增殖率較低氧組、低氧干擾組及低氧CAY組均明顯減少（P＜0.05）。低氧組與低氧陰性對照組差異不具顯著性（P＞0.05）。
　　2、流式細胞術Annexin-V/PE法檢測肝癌細胞凋亡改變：與空白組比較，HepG2、SMMC-7721細胞低氧組及低氧陰性對照細胞凋亡率減少；低氧環(huán)境下抑制HIF-2α或SCD1表達，HepG2、SMMC-7721細胞凋亡率較低氧組和低氧陰性對照組明顯升高（P＜0.05）；同時抑制H

13、IF-2α和SCD1表達，兩種肝癌細胞凋亡率較低氧組、低氧干擾組及低氧 CAY組均明顯增多（P＜0.05）。低氧組與低氧陰性對照組差異不具顯著性（P＞0.05）。
　　3、Transwell檢測肝癌細胞侵襲改變：與空白組比較，低氧組和低氧陰性對照組HepG2和SMMC-7721細胞侵襲指數(shù)提高。低氧環(huán)境下抑制HIF-2α或SCD1表達，HepG2、SMMC-7721細胞侵襲指數(shù)較低氧組明顯降低（P＜0.05）；同時抑制HIF-2α