1、隨著轉基因研究的不斷深入，人們將越來越多的研究興趣集中在生長迅速，培養(yǎng)簡單的單細胞綠藻上。利用單細胞綠藻進行遺傳轉化有其優(yōu)越性，與傳統的微生物發(fā)酵、動物細胞和轉基因動物等轉化系統相比，它不需要昂貴的設備和嚴格的培養(yǎng)條件，具有光合自養(yǎng)、培養(yǎng)成本低，易于轉化等優(yōu)點，是一類比較廉價和安全的生物反應器。 目前，對單細胞綠藻的轉化工作主要集中在兩大方向：細胞核轉化和葉綠體轉化。經過數十年的發(fā)展，植物的核轉化技術日臻成熟并得到了廣泛的應用，

2、但是核基因組的遺傳轉化仍存在一系列至今尚未解決的內在問題：如由于核基因組大、背景復雜、易出現基因失活、基因沉默、位置效應等現象；所表達的原核基因必須經過修飾改造，環(huán)境安全難以保證等。 而在葉綠體轉化系統中卻可以克服這些困難。與核轉化相比，葉綠體基因組小，遺傳操作簡單，外源基因是通過同源重組機制定點整合進葉綠體基因組。定點整合有利于人為控制外源基因的插入位點，可以將目的基因定位在適于表達的位點，能較好地解決“順式失活”、“位置效應

3、”等類的基因沉默問題。由于葉綠體中DNA分子有多個拷貝，同時葉綠體對表達產物的積累有較強的承受能力，保障了外源基因在葉綠體中的高效表達。另外，由于葉綠體基因組的原核性質，對來自原核生物的外源基因無需改造就可以在葉綠體內高效表達，而且可以將多個外源基因采取“多順反子”的原核表達形式同時引入，并由共同的啟動子控制，既方便操作又可避免由于存在多個相同啟動子所帶來的“共沉默”。這是核基因轉化無法做到的。杜氏鹽藻(以下簡稱鹽藻)是一種低等的單細胞

4、真核綠藻，屬綠藻門綠藻綱團藻目，進化樹分析顯示其與具有細胞壁的萊茵衣藻十分相似，沒有細胞壁，長約6-15岬，呈橢圓形或梨形，能依靠其雙鞭毛在水中游動。光鏡下可明顯看到其內含一個大型的杯狀葉綠體，約占細胞總體積的50％?？稍?.05M-5.5M的鹽水中生長，最佳生長繁殖鹽度為2M-3M，目前已知最耐鹽的真核生物。由于鹽藻可在高滲鹽溶液中生長，這是許多其它生物難以生存的環(huán)境，故其大規(guī)模培養(yǎng)不需昂貴的發(fā)酵罐或其他培養(yǎng)裝置，可以直接采用開放式培

5、養(yǎng)，大大降低生產成本，由于沒有細胞壁可很容易的用基因槍，電擊法等一系列轉化方法進行遺傳轉化，這些獨特使得杜氏鹽藻可被開發(fā)為一種生產藥用蛋白的良好宿主。 基于葉綠體轉化的優(yōu)越性以及鹽藻的獨特性，本實驗意欲在鹽藻中實現穩(wěn)定高效的葉綠體轉化。在我們以前的實驗中，初步的鹽藻葉綠體轉化系統已經構建成功，但是由于用于重組的同源片段長度不足使得得到的轉化系統不太穩(wěn)定。本實驗首先分離大量完整的葉綠體，進而抽提高純度葉綠體DNA(cpDNA)，利

6、用四個平端酶隨機切割cpDNA并連上特異設計的接頭(Linker)，構建四個葉綠體基因組步行文庫，通過巢式PCR擴增到足夠長度的同源片段，進而構建葉綠體轉化載體。 實驗方法 1．鹽藻完整葉綠體的分離及cpDNA的提取在進行鹽藻葉綠體的分離時，從某種程度上講對其大量高效的培養(yǎng)顯得至關重要。合適的培養(yǎng)條件一方面可以使細胞快速增殖，另一方面則可以保持整個生長過程中葉綠體保持良好的形態(tài)。我們在比較了不同的鹽藻生長的培養(yǎng)基的基礎上

7、，對UTEX液體培養(yǎng)液進行了部分改良，如將NaCl的濃度調至1M。 取對數生長后期的杜氏鹽藻細胞進行高壓破碎，利用差速離心和蔗糖密度梯度離心得到完整的葉綠體。采用優(yōu)化的SDS-proteinase K-酚/氯仿/異戊醇方案抽提得到高純度的cpDNA。 2．鹽藻chiN基因未知側翼區(qū)的擴增chlN被選擇用于我們進行葉綠體轉化的同源片段。它和chlL、chlB參與編碼光非依賴性的原葉綠素酸醋還原酶(DPOR)，任何一個基因的

8、破壞都阻斷黑暗條件下葉綠素的合成。chlL基因插入失活后，鹽藻還可通過光依賴性的原葉綠素酸醋還原酶系統(LPOR)完成葉綠素的合成，而不影響轉化藻的正常生存。 2.1鹽藻葉綠體基因組步行文庫的構建將抽提得到的高純度cpDNA分別用Dra I、EcoR V、Pvu Ⅱ和Stu I四個平端限制酶切，之后和特異的接頭連接制成葉綠體基因組步行文庫，作為巢式PCR擴增的模板。 2．2chlN基因未知上游側翼的擴增通過在chiN基因上游設計

9、特異引物，在制成的葉綠體基因組步行文庫中進行chiN基因未知上游的擴增。 2.3chlN基因未知下游側翼的擴增同樣，通過在chiN基因下游設計特異引物，在葉綠體基因組步行文庫中進行chiN基因未知下游的擴增。 3．鹽藻雙交換葉綠體轉化載體的構建及轉化結果的初步鑒定在新增同源片段的基礎上，對已有的葉綠體轉化載體進行改造，構建成鹽藻葉綠體轉化載體pMDko-bar以用于葉綠體轉化。用電擊轉化法轉化野生型鹽藻細胞。 實

10、驗結果 1．鹽藻完整葉綠體的分離及高純度cpDNA的制備蔗糖密度梯度離心結果表明分離到了大量的葉綠體，相差顯微鏡及電鏡觀察證實了所得葉綠體的完整性。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測cpDNA，并用紫外分光光度儀檢測cpDNA的濃度和純度，結果顯示，抽提到的cpDNA濃度約2.201μg/ml，A260/A280接近1.8，說明其含量及純度都達到了比較理想的狀態(tài)。 2．鹽藻chiN基因未知側翼區(qū)的擴增2．1chiN基因未知上游側翼的

11、擴增經過兩輪的擴增得到一條3000 bp的片段，測序結果顯示其3’端與以前實驗中用簡并引物擴增得到的1269 bp的chiN的5’端完全吻合。 2．1chiN基因未知下游側翼的擴增兩輪的擴增得到一條650 bp的片段，測序結果顯示其5’端與已知的1269 bp的chiN的3’端完全吻合。 3．鹽藻雙交換葉綠體轉化載體的構建及轉化的初步鑒定酶切鑒定雙交換葉綠體轉化載體pMDko-bar插入片段大小、方向均正確。轉過的藻株在

12、篩選壓力下，于一周后肉眼觀察到轉化藻株與陰性對照藻株(未加質粒，電擊轉化后加入．PPT)生長狀態(tài)存在明顯差異。而與陽性對照(未加質粒，電擊轉化后不加PPT)的生長狀態(tài)并無很大差別。則可以推知已將目的基因成功轉入鹽藻葉綠體。結論1．在分離到了大量完整的鹽藻葉綠體基礎上，通過對傳統方案的優(yōu)化得到足量的高純度cpDNA。 2．從構建的鹽藻葉綠體基因組步行文庫中成功擴增得到用于葉綠體遺傳轉化的同源片段，并構建了葉綠體轉化載體。