1、第一部分 目的：檢測病毒性肝炎后肝硬化組織中是否存在納米細菌，并對可能存在的納米細菌進行分離、鑒定及培養(yǎng)。 方法：手術(shù)中獲取的12例病毒性肝炎后肝硬化組織及12例正常肝組織標本，分別切取部分存于4％中性甲醛溶液中作石蠟包埋切片，以免疫組化法作納米細菌檢測。其余液氮速凍后存于-70℃冰箱，留作納米細菌的分離，納米細菌單克隆抗體間接免疫熒光法和電鏡檢測進行鑒定。對分離的納米細菌進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中檢測電解質(zhì)及葡萄糖濃度的變化

2、。 結(jié)果：12例病毒性肝炎后肝硬化組織中10例納米細菌檢測陽性，2例陰性，12例正常肝組織中1例納米細菌檢測陽性，11例陰性，肝硬化組織中納米細菌感染率高于正常肝組織(P<0.05)。納米細菌單克隆抗體間接免疫熒光法檢測時，納米細菌可發(fā)出綠色熒光。透射電鏡下測量納米細菌直徑大小約為100～300nm。納米細菌培養(yǎng)過程中，K+、Na+、Cl-、Mg2+及葡萄糖的濃度無明顯變化(P>0.05)，而Ca2+、P3-濃度進行性下降，每周

3、檢測結(jié)果比較存在顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論：病毒性肝炎后肝硬化組織中存在納米細菌。納米細菌單克隆抗體間接免疫熒光法快速準確鑒定納米細菌，電鏡有助于納米細菌檢測。納米細菌培養(yǎng)生長過程中消耗Ca2+、P3-，而不利用K+、Na+、Cl-、Mg2+及葡萄糖。 第二部分納米細菌對人正常肝細胞生物學形態(tài)的影響 目的：觀察納米細菌對人正常肝細胞生物學形態(tài)的變化及是否有損傷作用。 方法：光鏡下觀察不同濃度納米細

4、菌作用于人正常肝細胞24小時和48小時后生物學形態(tài)的改變；MTT比色實驗和LDH釋放試驗檢測不同濃度納米細菌作用后人正常肝細胞存活和增殖情況，并檢測不同時間點NO的變化。 結(jié)果：不同濃度納米細菌作用后，光鏡下觀察人正常肝細胞形態(tài)存在不同程度改變，極低濃度時(OD=0.001,0.009)無明顯變化，隨濃度增加和作用時間延長，正常肝細胞外觀上逐漸出現(xiàn)細胞容量增加，腫脹，輪廓不清，細胞膜損傷破裂，甚至完全解體而無細胞結(jié)構(gòu)。不同濃度納

5、米細菌作用48小時后：除OD=0.001組外，各濃度組MTT值低于對照組MTT值，存在顯著性差異(P<0.05)，各濃度組之間比較存在顯著性差異(P<0.05)。作用72小時后：OD=0.137組和OD=0.246組的MTT值比較無顯著性差異(P>0.05)，其余各濃度組之間比較仍存在顯著性差異(P<0.05)。比較不同時間點(48小時和72小時)：OD=0.001，0.009時72小時的MTT值高于48小時的MTT值(P<0.05)。

6、OD=0.018，0.031，0.048，0.137時72小時的MTT值低于48小時的MTT值(P<0.05)。OD=0.246時48小時的MTT值和72小時的MTT值比較無顯著性差異(P>0.05)。不同濃度納米細菌作用于正常肝細胞時的LDH值差異有統(tǒng)計學意義(F=712.064，P<0.01)，不同時間點的LDH值差異有統(tǒng)計學意義(F=432.120,P<0.01)。納米細菌濃度與作用時間之間存在交互效應(F=217.308,P<0

7、.01)。與正常肝細胞組相比較，除OD=0.001組納米細菌與其差異無統(tǒng)計學意義(P=0.835)外，其余各組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著納米細菌濃度的逐步提高，各時間點LDH從細胞內(nèi)釋放的量逐漸升高，并與0小時比較存在顯著性差異(P<0.05)。NO檢測：不同濃度納米細菌作用于人正常肝細胞時，除OD=0.001.組與正常肝細胞對照組差異無統(tǒng)計學意義外(P=0.206)，其余各組與對照組及不同濃度NB組兩兩比較

8、均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同時間點兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。納米細菌濃度與作用時間之間有交互作用(F=625.454，P<0.001)。 結(jié)論：納米細菌可以損傷人正常肝細胞，隨著濃度升高及作用時間延長，損傷程度越重，且在作用過程中產(chǎn)生NO，存在著濃度和時間依賴關(guān)系。 第三部分納米細菌損傷人正常肝細胞機制的初步探討 目的：探討納米細菌對人正常肝細胞的損傷機制。 方法：采用線粒體探

9、針觀察不同濃度納米細菌作用人正常肝細胞時，在不同時間點線粒體通透性孔道的開放情況，并結(jié)合電鏡下線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變，三磷酸腺苷檢測和流式細胞儀檢測。 結(jié)果：(1)OD=0.001納米細菌作用于正常肝細胞6小時后，即可以觀察到線粒體瞬時通透性孔道有一定程度的開放，部分線粒體跨膜電位出現(xiàn)下降。隨著作用時間的延長，更多的線粒體瞬時通透性孔道進一步開放，至36小時，鈣黃綠素熒光強度進一步減弱，MitoTracker CMXRos熒光由于

10、線粒體的崩解，彌散分布于細胞內(nèi)。48小時，整個視野的鈣黃綠素熒光強度明顯黯淡，MitoTrackerCMXRos熒光在細胞內(nèi)的分布顯得紊亂，無法分辨線粒體外形。結(jié)合同時間點電鏡圖片可以發(fā)現(xiàn)此時的線粒體出現(xiàn)明顯的嵴丟失及空泡化。至72小時，幾乎無鈣黃綠素熒光，視野的底色顯示為熒光染料的殘跡，MitoTracker CMXRos熒光強度黯淡，分布于細胞質(zhì)內(nèi)散在聚集，線粒體跨膜電位完全消失。整個過程中，細胞核仍然維持完整。OD=0.246納米

11、細菌作用于正常肝細胞3小時即可觀察到PTP開放，6小時即可以看到鈣黃綠素熒光明顯減弱，線粒體跨膜電位已經(jīng)開始出現(xiàn)下降。12小時，鈣黃綠素熒光進一步減弱，部分線粒體跨膜電位的降低及消失。14小時，線粒體已經(jīng)破裂，MitoTracker CMXRos熒光染料外溢至細胞質(zhì)內(nèi)。16小時，鈣黃綠素熒光基本消失，大部分線粒體的跨膜電位消失。24小時，僅僅殘留著鈣黃綠素熒光染料及MitoTracker CMXRos染料痕跡，已無完整的細胞核及細胞形態(tài)

12、。 (2)OD=0.001納米細菌作用于正常肝細胞36小時，電鏡下可以看到細胞內(nèi)大部分線粒體已經(jīng)廣泛空泡化，嵴丟失。在OD=0.246作用正常肝細胞12小時，電鏡下觀察到線粒體變得腫脹，嵴結(jié)構(gòu)紊亂，16小時則觀察到肝細胞線粒體均已經(jīng)空泡化，但是細胞核仍維持完整。 (3)OD=0.246組納米細菌攻擊正常肝細胞6小時引起凋亡。 OD=0.001組納米細菌作用于正常肝細胞24小時，細胞凋亡。OD=0.018組納米細菌

13、作用24小時僅僅出現(xiàn)一個較低的凋亡峰。 (4)三磷酸腺苷檢測：不同濃度的納米細菌作用人正常肝細胞時RLU值有統(tǒng)計學意義(F=7.808,P=0.013)。正常肝細胞組與OD=0.001，0.018組之間RLU值差異無統(tǒng)計學意義(P=0.614，0.213)，而與OD=0.048,0.137及0.246組之間均有統(tǒng)計學意義(P=0.034，0.004，0.004)。OD=0.137與0.246組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.970

14、)。不同時間點之間RLU差異有統(tǒng)計學顯著意義(F=251.181,P<0.001)，除0.5小時與0小時(P=0.144)，0.5小時與1小時之間(P=0.053)，6小時與48小時(P=0.080)，12小時與24小時之間(P=0.366)之間差異無統(tǒng)計學意義外，余各時間點兩兩比較RLU值差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。納米細菌濃度與攻擊時間有交互作用(F=142.551，P<0.001)。 結(jié)論： 1.納米細菌對