1、第一部分、“清活Ⅰ號(hào)”中藥復(fù)方拮抗高糖導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用及機(jī)制研究
　　 目的：血管并發(fā)癥是糖尿病患者首要的致殘與致死因素。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的根本機(jī)制在于內(nèi)皮細(xì)胞線粒體活性氧簇(ROS)生成過多。前期研究已證實(shí)“清活Ⅰ號(hào)”中藥復(fù)方(QHYH)體內(nèi)可以降低2型糖尿病患者尿微量白蛋白排泄率，體外可以改善高濃度葡萄糖抑制的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究的目的是研究“清

2、活Ⅰ號(hào)”拮抗高糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化機(jī)制。最近有研究表明，基因水平抑制解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的表達(dá)可使內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成增加。因此，我們也研究了UCP2的表達(dá)變化是否與高糖導(dǎo)致小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成增加有關(guān)，及UCP2是否參與QHYH的抗氧化應(yīng)激作用。
　　 方法：bEnd.3細(xì)胞分別以正常濃度葡萄糖(NG，5.6 mM)、高濃度葡萄糖(HG，25mM)、高糖加“清活Ⅰ號(hào)”(1:100稀釋)培養(yǎng)。分別以

3、H2DCF-DA和DAF-FMDA熒光探針檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞ROS和一氧化氮(NO)的生成。UCP2 mRNA水平以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。內(nèi)皮源性一氧化氮合酶(eNOS)、Akt磷酸化水平及UCP2蛋白表達(dá)水平以western blotting檢測(cè)。以UCP2 siRNA進(jìn)行RNA干擾抑制UCP2表達(dá)。
　　 結(jié)果：高糖增加bEnd.3細(xì)胞ROS生成，HG組ROS生成較NG組增加(142.27±11.44％vs.100.00±1.9

4、2％in NG group，P<0.01)，同時(shí)使UCP2表達(dá)下調(diào)：高糖對(duì)UCP2 mRNA的抑制呈濃度依賴性，35mM時(shí)作用最強(qiáng)(69.90±4.84％，P<0.01 vs.NG group)，也呈時(shí)間依賴性，35 mM葡萄糖作用48小時(shí)抑制作用最強(qiáng)(66.93±4.73％，P<0.001 vs.0h group)。高濃度葡萄糖(35 mM)抑制eNOSSer1177和Akt Ser473的磷酸化(45.49±2.51％and76.7

5、1±4.00％，P<0.01 vs.NG group)抑制bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞NO生成(53.83±3.98％，P<0.01 vs.NG group).向高糖培養(yǎng)基中加“清活Ⅰ號(hào)”，可逆轉(zhuǎn)高糖導(dǎo)致的ROS生成增加(53.65±8.11％vs.142.27±11.44％in HG group，P<0.001)、改善eNOS與Akt磷酸化(72.81±7.02％vs.45.49±2.51％in HG group，P<0.05 and120.

6、98±1.20％vs.76.71±4.00％in HG group，P<0.001)、NO生成(118.82±2.95％vs.53.83±3.98％in HG group，P<0.001)、及UCP2蛋白表達(dá)(94.09±6.30％vs.53.83±3.98％in HG group，P<0.001).通過UCP2 siRNA抑制UCP2蛋白表達(dá)后，“清活Ⅰ號(hào)”拮抗高糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激的作用減輕，不能改善高糖誘導(dǎo)的ROS生成及NO產(chǎn)生的下調(diào)

7、。
　　 結(jié)論：“清活Ⅰ號(hào)”可通過抑制ROS生成，促進(jìn)Akt、eNOS磷酸化和NO生成，拮抗高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激?！扒寤睥裉?hào)”保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用可能部分與其上調(diào)UCP2的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果提示“清活Ⅰ號(hào)”作為抗氧化劑治療糖尿病血管并發(fā)癥具有應(yīng)用前景。
　　 第二部分“清活I(lǐng)號(hào)”分離物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成的影響及機(jī)制探討
　　 目的：前期研究已證實(shí)“清活I(lǐng)號(hào)"中藥復(fù)方具有抗氧化應(yīng)激作用。本實(shí)驗(yàn)的目的是對(duì)“清

8、活I(lǐng)號(hào)”中藥復(fù)方進(jìn)行分離提純?nèi)?，檢測(cè)其分離物抑制ROS生成的作用，明確“清活I(lǐng)號(hào)”中藥復(fù)方中參與氧化應(yīng)激作用的化合物，并探討所篩選化合物抗氧化應(yīng)激的作用機(jī)理。解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的表達(dá)可抑制內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成增加。高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞UCP2的表達(dá)具有抑制作用。我們的研究也證實(shí)了“清活I(lǐng)號(hào)"可改善高糖對(duì)UCP2的抑制作用，“清活I(lǐng)號(hào)”的抗氧化應(yīng)激作用可能與其改善UCP2表達(dá)有關(guān)。因此檢測(cè)了“清活I(lǐng)號(hào)"分離所得化合物對(duì)bEnd.3細(xì)胞UCP

9、2 mRNA水平的影響。NADPH氧化酶是內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的重要來源。NADPH氧化酶由gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox等亞單位組成，因此本實(shí)驗(yàn)擬檢測(cè)有效化合物對(duì)bEnd.3細(xì)胞NADPH氧化酶gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox基因表達(dá)的影響。
　　 方法：以溶劑萃取法對(duì)“清活I(lǐng)號(hào)"水煎劑進(jìn)行分離，獲得3個(gè)部分。以大孔樹脂法對(duì)清活I(lǐng)號(hào)進(jìn)行分離，獲得5個(gè)部分。bEnd．

10、3細(xì)胞分別以正常濃度葡萄糖(NG，5.6 mM)、高濃度葡萄糖(HG，25 mM)、高糖加不同濃度“清活I(lǐng)號(hào)”分離提取物培養(yǎng)。以H2DCF-DA熒光探針檢測(cè)bEnd.3細(xì)胞及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(mⅣEC)ROS的生成。以MTT法檢測(cè)“清活I(lǐng)號(hào)”分離物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd.3細(xì)胞與HUVEC細(xì)胞)增殖的影響。以MCI硅膠層析、反復(fù)柱層析等方法對(duì)有效部分進(jìn)一步分離提取。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)“清活I(lǐng)號(hào)"分離所得有效化合物對(duì)bEnd．3細(xì)胞U

11、CP2、gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox mRNA水平的影響。
　　 結(jié)果：自“清活I(lǐng)號(hào)"水煎劑中先后分離出28種粗提部分，通過對(duì)抑制高糖刺激ROS生成活性的篩選及進(jìn)一步分離，共分離出12個(gè)化合物單體，其中9個(gè)為已知化合物，包括京尼平苷酸、京尼平苷、黃芪甲苷、葛根素、陳皮苷、西紅花苷、川芎嗪、阿魏酸、綠原酸，文獻(xiàn)均報(bào)道過其具有抗氧化活性。另三個(gè)化合物：E3-M15-1、E3．M15-2和E1．H1

12、-1，結(jié)構(gòu)暫未知，亦不明確其是否具有抗氧化活性。抑制高糖刺激ROS生成活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)西紅花苷、川芎嗪、阿魏酸、綠原酸、E3-M15-1、E3-M15-2和E1-H1-1在兩種細(xì)胞模型(bEnd.3細(xì)胞與HUVEC細(xì)胞)上對(duì)高糖刺激ROS生成均有抑制作用，且對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞無明顯毒性作用(E3-M15-2高濃度組除外)。
　　 高濃度葡萄糖可抑制bEnd．3細(xì)胞UCP2 mRNA水平，“清活I(lǐng)號(hào)"及其分離物(西紅花苷、川芎嗪、阿魏酸、綠

13、原酸、E3．M15-1、E3．M15-2和E1-H1-1)可不同程度使UCP2 mRNA水平恢復(fù)。高濃度葡萄糖可使gp91phox、p22Phox、p67phox mRNA表達(dá)升高；“清活I(lǐng)號(hào)”及川芎嗪可抑制高糖誘導(dǎo)的gp91phox、p22phox、p67phox mRNA升高；西紅花苷可抑制高糖上調(diào)的gp91phox與p67phox mRNA水平；E3-M15-1可抑制高糖上調(diào)的gp91phox、p22phox mRNA水平，阿魏酸

14、、綠原酸僅可抑制高糖上調(diào)的p22phox mRNA水平。
　　 結(jié)論：“清活I(lǐng)號(hào)"分離物西紅花苷、川芎嗪、阿魏酸、綠原酸、E3-M15-1、E3-M15-2和E1-H1-1對(duì)高糖刺激ROS生成均有抑制作用，為“清活I(lǐng)號(hào)”抗氧化應(yīng)激作用的重要組成部分。“清活I(lǐng)號(hào)"及其分離物(西紅花苷、川芎嗪、阿魏酸、綠原酸、E1-H1-1)的抗氧化應(yīng)激作用可能與其改善高糖對(duì)UCP2 mRNA的抑制及抑制高糖上調(diào)的NADPH氧化酶rnRNA水平有關(guān)