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文檔簡介
1、第一部分、“清活Ⅰ號”中藥復方拮抗高糖導致血管內皮細胞氧化應激的作用及機制研究
目的:血管并發(fā)癥是糖尿病患者首要的致殘與致死因素。內皮細胞功能紊亂在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。內皮細胞功能紊亂的根本機制在于內皮細胞線粒體活性氧簇(ROS)生成過多。前期研究已證實“清活Ⅰ號”中藥復方(QHYH)體內可以降低2型糖尿病患者尿微量白蛋白排泄率,體外可以改善高濃度葡萄糖抑制的微血管內皮細胞的生長。本研究的目的是研究“清
2、活Ⅰ號”拮抗高糖導致的氧化應激、保護內皮細胞的抗氧化機制。最近有研究表明,基因水平抑制解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的表達可使內皮細胞ROS生成增加。因此,我們也研究了UCP2的表達變化是否與高糖導致小鼠腦微血管內皮細胞ROS生成增加有關,及UCP2是否參與QHYH的抗氧化應激作用。
方法:bEnd.3細胞分別以正常濃度葡萄糖(NG,5.6 mM)、高濃度葡萄糖(HG,25mM)、高糖加“清活Ⅰ號”(1:100稀釋)培養(yǎng)。分別以
3、H2DCF-DA和DAF-FMDA熒光探針檢測內皮細胞ROS和一氧化氮(NO)的生成。UCP2 mRNA水平以實時熒光定量PCR檢測。內皮源性一氧化氮合酶(eNOS)、Akt磷酸化水平及UCP2蛋白表達水平以western blotting檢測。以UCP2 siRNA進行RNA干擾抑制UCP2表達。
結果:高糖增加bEnd.3細胞ROS生成,HG組ROS生成較NG組增加(142.27±11.44%vs.100.00±1.9
4、2%in NG group,P<0.01),同時使UCP2表達下調:高糖對UCP2 mRNA的抑制呈濃度依賴性,35mM時作用最強(69.90±4.84%,P<0.01 vs.NG group),也呈時間依賴性,35 mM葡萄糖作用48小時抑制作用最強(66.93±4.73%,P<0.001 vs.0h group)。高濃度葡萄糖(35 mM)抑制eNOSSer1177和Akt Ser473的磷酸化(45.49±2.51%and76.7
5、1±4.00%,P<0.01 vs.NG group)抑制bEnd.3內皮細胞NO生成(53.83±3.98%,P<0.01 vs.NG group).向高糖培養(yǎng)基中加“清活Ⅰ號”,可逆轉高糖導致的ROS生成增加(53.65±8.11%vs.142.27±11.44%in HG group,P<0.001)、改善eNOS與Akt磷酸化(72.81±7.02%vs.45.49±2.51%in HG group,P<0.05 and120.
6、98±1.20%vs.76.71±4.00%in HG group,P<0.001)、NO生成(118.82±2.95%vs.53.83±3.98%in HG group,P<0.001)、及UCP2蛋白表達(94.09±6.30%vs.53.83±3.98%in HG group,P<0.001).通過UCP2 siRNA抑制UCP2蛋白表達后,“清活Ⅰ號”拮抗高糖導致的氧化應激的作用減輕,不能改善高糖誘導的ROS生成及NO產生的下調
7、。
結論:“清活Ⅰ號”可通過抑制ROS生成,促進Akt、eNOS磷酸化和NO生成,拮抗高糖誘導的內皮細胞氧化應激。“清活Ⅰ號”保護內皮細胞的作用可能部分與其上調UCP2的表達有關。本研究結果提示“清活Ⅰ號”作為抗氧化劑治療糖尿病血管并發(fā)癥具有應用前景。
第二部分“清活I號”分離物對內皮細胞ROS生成的影響及機制探討
目的:前期研究已證實“清活I號"中藥復方具有抗氧化應激作用。本實驗的目的是對“清
8、活I號”中藥復方進行分離提純取,檢測其分離物抑制ROS生成的作用,明確“清活I號”中藥復方中參與氧化應激作用的化合物,并探討所篩選化合物抗氧化應激的作用機理。解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的表達可抑制內皮細胞ROS生成增加。高糖對內皮細胞UCP2的表達具有抑制作用。我們的研究也證實了“清活I號"可改善高糖對UCP2的抑制作用,“清活I號”的抗氧化應激作用可能與其改善UCP2表達有關。因此檢測了“清活I號"分離所得化合物對bEnd.3細胞UCP
9、2 mRNA水平的影響。NADPH氧化酶是內皮細胞中ROS的重要來源。NADPH氧化酶由gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox等亞單位組成,因此本實驗擬檢測有效化合物對bEnd.3細胞NADPH氧化酶gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox基因表達的影響。
方法:以溶劑萃取法對“清活I號"水煎劑進行分離,獲得3個部分。以大孔樹脂法對清活I號進行分離,獲得5個部分。bEnd.
10、3細胞分別以正常濃度葡萄糖(NG,5.6 mM)、高濃度葡萄糖(HG,25 mM)、高糖加不同濃度“清活I號”分離提取物培養(yǎng)。以H2DCF-DA熒光探針檢測bEnd.3細胞及人臍靜脈內皮細胞(mⅣEC)ROS的生成。以MTT法檢測“清活I號”分離物對內皮細胞(bEnd.3細胞與HUVEC細胞)增殖的影響。以MCI硅膠層析、反復柱層析等方法對有效部分進一步分離提取。以實時熒光定量PCR檢測“清活I號"分離所得有效化合物對bEnd.3細胞U
11、CP2、gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox mRNA水平的影響。
結果:自“清活I號"水煎劑中先后分離出28種粗提部分,通過對抑制高糖刺激ROS生成活性的篩選及進一步分離,共分離出12個化合物單體,其中9個為已知化合物,包括京尼平苷酸、京尼平苷、黃芪甲苷、葛根素、陳皮苷、西紅花苷、川芎嗪、阿魏酸、綠原酸,文獻均報道過其具有抗氧化活性。另三個化合物:E3-M15-1、E3.M15-2和E1.H1
12、-1,結構暫未知,亦不明確其是否具有抗氧化活性。抑制高糖刺激ROS生成活性檢測發(fā)現(xiàn)西紅花苷、川芎嗪、阿魏酸、綠原酸、E3-M15-1、E3-M15-2和E1-H1-1在兩種細胞模型(bEnd.3細胞與HUVEC細胞)上對高糖刺激ROS生成均有抑制作用,且對內皮細胞無明顯毒性作用(E3-M15-2高濃度組除外)。
高濃度葡萄糖可抑制bEnd.3細胞UCP2 mRNA水平,“清活I號"及其分離物(西紅花苷、川芎嗪、阿魏酸、綠
13、原酸、E3.M15-1、E3.M15-2和E1-H1-1)可不同程度使UCP2 mRNA水平恢復。高濃度葡萄糖可使gp91phox、p22Phox、p67phox mRNA表達升高;“清活I號”及川芎嗪可抑制高糖誘導的gp91phox、p22phox、p67phox mRNA升高;西紅花苷可抑制高糖上調的gp91phox與p67phox mRNA水平;E3-M15-1可抑制高糖上調的gp91phox、p22phox mRNA水平,阿魏酸
14、、綠原酸僅可抑制高糖上調的p22phox mRNA水平。
結論:“清活I號"分離物西紅花苷、川芎嗪、阿魏酸、綠原酸、E3-M15-1、E3-M15-2和E1-H1-1對高糖刺激ROS生成均有抑制作用,為“清活I號”抗氧化應激作用的重要組成部分。“清活I號"及其分離物(西紅花苷、川芎嗪、阿魏酸、綠原酸、E1-H1-1)的抗氧化應激作用可能與其改善高糖對UCP2 mRNA的抑制及抑制高糖上調的NADPH氧化酶rnRNA水平有關
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