1、植物長期連作容易引起植物病原微生物富集，植物有益微生物數(shù)量減少，土壤微生物區(qū)系從細菌主導型向真菌主導型轉化，最終導致土壤微生物群落結構與組成失衡，使病原菌更容易侵染植物而引起植物的各種土傳病害頻發(fā)，如連作土傳枯萎病。因此對土壤微生物區(qū)系的研究對防控植物連作土傳病害具有重要的意義。
　　本研究首先分析比較了不同的真菌標靶基因(28S rRNA和ITS轉錄間隔區(qū))以及鑒定數(shù)據(jù)庫(LSU，WARCUP和UNITE)對真菌微生物區(qū)系測序數(shù)

2、據(jù)分析結果的影響，得出適合用于本研究的真菌標靶基因與鑒定數(shù)據(jù)庫;進而通過比較健康與發(fā)病香蕉根際土壤微生物區(qū)系差異得出健康香蕉根際土壤微生物群落的指示類群;進而篩選出能有效抑制香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴專化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense，F(xiàn)OC)生長的拮抗菌;將該拮抗菌進行全基因組測序，進一步分析其生防潛力;通過比較基因組研究設計能夠精確定量該拮抗菌的特異性引物;進而測試該拮抗菌在土壤中的存活能力;最

3、后將拮抗菌制成微生物有機肥(BIO),通過BIO營養(yǎng)缽育苗以及在田間穴施BIO在香蕉根際培育一個以有益微生物為主導的健康微生物區(qū)系，從而起到防控香蕉土傳枯萎病的目的。主要研究結果有以下幾點:
　　1.選用不同的真菌標靶基因(ITS，28S rRNA)與真菌鑒定數(shù)據(jù)庫(LSU,UNITE和WARCUP)對玉米，芒草與柳枝稷根際真菌群落的研究都得到一致的結論:一年生作物（玉米）的根際的真菌類群最特殊，作物類型是影響其根際真菌區(qū)系的首要

4、因子。說明這些真菌標靶基因與鑒定數(shù)據(jù)庫對揭示處理間真菌群落結構的差異沒有很大影響。盡管如此，受標靶基因引物覆蓋度以及真菌鑒定數(shù)據(jù)庫的覆蓋度與復雜性的影響，標靶基因與數(shù)據(jù)庫對真菌高通量測序數(shù)據(jù)分析結果中的某些類群的相對豐度影響顯著。使用28S rRNA標靶基因未能檢測到Fusarium，Phoma和Verticillum等真菌類群，而這些類群在使用ITS標靶基因得到的分析結果中屬于相對豐度非常高的主要真菌類群，這些類群包含了著名的植物病原

5、菌;而使用ITS標靶基因未能檢測到Orbicula等真菌類群;Eupenicillium在使用ITS標靶基因配合UNITE數(shù)據(jù)庫分析的結果中沒有出現(xiàn)，在ITS標靶基因配合WARCUP數(shù)據(jù)庫的分析結果中占比較小，而在28S rRNA配合LSU數(shù)據(jù)庫的分析結果中為第四名豐度最高的真菌類群。由于使用WARCUP數(shù)據(jù)庫對ITS序列進行鑒定的結果在可鑒定類群數(shù)量與比例，鑒定結果有效性等方面都要優(yōu)于UNITE數(shù)據(jù)庫，并且鑒于Fusarium真菌屬包

6、含了本研究香蕉枯萎病的病原菌FOC，對本研究的意義重大，因此本研究關于香蕉根際真菌區(qū)系的研究選用ITS標靶基因配合WARCUP真菌ITS數(shù)據(jù)庫進行。
　　2.香蕉根際微生物區(qū)系與香蕉植株健康狀況息息相關。16S rRNA基因克隆建庫測序的結果表明Bacillus是健康香蕉根際土壤中相對豐度最高的細菌類群;高通量測序結果表明，Bacillus是健康與發(fā)病香蕉植株根際細菌區(qū)系差異的主要貢獻者之一，是健康香蕉根際細菌區(qū)系的指示類群。健康

7、的樣品中Bacillus的相對豐度顯著高于發(fā)病樣品。Fusarium是發(fā)病香蕉根際土壤中的主要類群，其在發(fā)病香蕉樣品中的相對豐度與數(shù)量要顯著高于健康樣品。Fusarium是指示健康與發(fā)病香蕉植株根際真菌區(qū)系差異的最主要貢獻者，是發(fā)病香蕉根際真菌區(qū)系的指示類群。Bacillus的相對豐度與Fusarium的相對豐度與數(shù)量呈顯著負相關關系。根據(jù)以上結果推測，如果能在香蕉根際增加Bacillus的數(shù)量而降低Fusarium的數(shù)量將有利于防控香

8、蕉枯萎病，Bacillus與Fusarium的比值可以作為監(jiān)測預警香蕉枯萎病發(fā)生的指標。
　　3.將從健康香蕉根際土壤懸液中分離到的細菌菌落與香蕉枯萎病病原菌FOC進行平板對峙培養(yǎng)，獲得能高效抑制FOC生長的菌株NJN-6。通過構建16S rRNA發(fā)育樹以及將菌株NJN-6全基因組測序鑒定該菌株為Bacillus amyloliquefaciens。菌株NJN-6的全基因組注釋結果表明該菌株基因組含有一個由11個基因組成的合成pe

9、nicillin的基因簇，擁有43個與脂肽類物質合成相關的基因，91個與孢子產生和萌發(fā)相關的基因，是潛在的植物病害的生防菌。通過與菌株B.amyloliquefaciens FZB42的全基因組比較獲得菌株NJN-6基因組中的特異性片段，進而設計得到用于精確定量NJN-6菌株的特異性引物，從而能夠在土壤中定量監(jiān)測菌株NJN-6的動態(tài)變化，進一步研究菌株NJN-6在土壤中的存活能力。菌株NJN-6土壤存活能力測試包括兩個處理:1）將菌株發(fā)

10、酵液直接添加到土壤中(IS);2)將菌株發(fā)酵液與有機肥混合后制成微生物有機肥后添加到土壤中(BIO)。研究發(fā)現(xiàn)接種后，7天內菌株NJN-6能在土壤中維持相對較高的數(shù)量，15天后數(shù)量驟減，30天后在土壤中的數(shù)量基本維持穩(wěn)定。添加有機肥有利于提高菌株NJN-6在土壤中的存活數(shù)量，減緩其死亡速率，有利于菌株NJN-6在土壤中發(fā)揮生防效果。
　　4.將菌株NJN-6與氨基酸有機肥混合通過二次發(fā)酵制成BIO，并通過BIO營養(yǎng)缽育苗以及田間穴

11、施BIO顯著降低了香蕉枯萎病的發(fā)病率，生防率達68％，香蕉產量較對照處理翻了一番。高通量測序的結果再次證明Bacillus是健康香蕉根際土壤中相對豐度最高的細菌類群，是健康香蕉根際細菌區(qū)系的指示類群。發(fā)病香蕉根際土壤中Fusarium的數(shù)量顯著高于健康樣品。Fusarium的數(shù)量與香蕉產量呈顯著負相關關系，與香蕉枯萎病發(fā)病率呈顯著正相關關系。Bacillus的相對豐度與Fusarium的數(shù)量呈顯著負相關關系。香蕉植株健康狀況與香蕉根際細

12、菌微生物區(qū)系具有顯著相關性，健康香蕉根際細菌微生物區(qū)系與發(fā)病樣品具有顯著差異。盡管如此，MRT分析表明BIO處理對香蕉根際細菌微生物區(qū)系的影響大于植株健康狀況對其的影響。BIO在香蕉根際培育了一個以有益微生物(Bacillus spp.)為主導的微生物區(qū)系，降低了FOC在根際的定殖數(shù)量，最終實現(xiàn)了防控香蕉土傳枯萎病的目的。
　　本研究以香蕉枯萎病為例，展示了開發(fā)新型微生物有機肥防控土傳病害的整個過程:1）健康香蕉根際土壤微生物區(qū)系