1、背景：目前，我國糖尿病的發(fā)病率已經達到9.7％，究其原因，主要是由于人民生活水平的提高，生活方式的迅速改變，進而導致糖尿病的發(fā)病率也快速增長。糖尿病除了引起血管及神經系統(tǒng)并發(fā)癥外，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也密切相關。研究顯示，2型糖尿病患者發(fā)生結直腸癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤的風險顯著高于一般人群。糖尿病已經成為嚴重威脅人類健康的疾病之一。二甲雙胍作為一種胰島素增敏劑，已經廣泛應用于2型糖尿病患者的治療。臨床研究顯示二甲雙胍對腫瘤患者具有

2、一定的保護作用。使用二甲雙胍降糖治療的2型糖尿病患者惡性腫瘤發(fā)生的風險性與使用磺脲類降糖藥物的患者相比下降了23％，并且腫瘤相關死亡率也顯著降低。Diabetologia上的一項隊列研究顯示，胰島素或胰島素促泌劑的治療與惡性腫瘤風險的增加相關，聯(lián)用二甲雙胍能使其增加的風險顯著降低。二甲雙胍的應用與糖尿病患者結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。Zhang ZL等通過對108161名2型糖尿病患者的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，使用二甲雙胍治療可以顯著降低結直腸

3、癌的發(fā)病率。Lee JH等經過41個月的隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，患有結直腸癌的糖尿病患者，在結腸癌術后口服二甲雙胍與其它降糖方案相比，總的死亡率及結直腸癌相關的死亡率均顯著降低。Lee MS等通過隊列研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者結腸癌的發(fā)病率是非糖尿病患者的2倍，而口服二甲雙胍的糖尿病患者結腸癌的發(fā)病率與非糖尿病患者一致。Hosono K等通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，結腸鏡檢有結腸變性隱窩病灶（癌前病變）的患者口服二甲雙胍(250mg/d)1個月后，病灶數(shù)目顯著

4、減少，同時腸上皮細胞的增殖能力也顯著降低。關于二甲雙胍抗癌作用的機制尚不完全清楚，目前的研究多認為與其發(fā)揮降糖作用的機制相關。一系列的研究顯示，2型糖尿病患者的高血糖及高胰島素血癥狀態(tài)導致其發(fā)生惡性腫瘤的風險性顯著高于一般人群。口服二甲雙胍可以降低2型糖尿病患者機體內的胰島素抵抗、改善高胰島素血癥，從而達到抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的目的。近年來，體外實驗證實二甲雙胍可以抑制腫瘤細胞的增殖、促進細胞凋亡，其本身存在著直接的抗腫瘤活性。二甲雙胍可

5、以有效激活AMP活化的蛋白激酶(AMPK)及其下游通路，使肝臟糖異生減少，同時增加外周組織對糖的攝取和利用，進而降低血糖。AMP與人體內的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、p53/p21途徑、mTOR通路、脂肪酸代謝相關通路、蛋白質代謝相關通路等多種信號傳導通路相關。AMPK的活化可以阻斷細胞內蛋白質的合成，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。近來，許多研究顯示，二甲雙胍具有殺傷腫瘤干細胞的作用。腫瘤干細胞是存在于腫瘤組織中的一小部分具有干細

6、胞性質的細胞群體，均具有自我更新能力和不定向分化潛能，可以導致腫瘤的發(fā)生?，F(xiàn)認為腫瘤干細胞是腫瘤形成及其不斷生長的根源。Vazquez等研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍通過降低主要驅動因子（轉錄因子ZEB1、TWIST1、SNA12）的表達，抑制上皮間質轉化(EMT)，從而減少乳腺癌腫瘤干細胞的產生。Soritau等通過對Ⅲ和Ⅳ期多形性膠質母細胞瘤患者的手術標本進行組織培養(yǎng)，從中提取的腫瘤細胞具有干細胞的特征，該細胞對常規(guī)的化療藥物替莫唑胺(TMZ)

7、耐藥，而替莫唑胺合用二甲雙胍較單獨使用替莫唑胺對腫瘤細胞的抑制率明顯增加。Lliopoulos等通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，一定劑量的阿霉素可以抑制裸鼠體內移植的腫瘤組織（包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌）的生長和復發(fā)，而合用二甲雙胍后原劑量1/4的阿霉素對腫瘤組織的抑制效果與之前的劑量相比，無明顯差異，考慮是由于二甲雙胍能夠特異性殺傷對化療藥物阿霉素耐藥的腫瘤干細胞。Oliveras等發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以使乳腺癌細胞MCF-7中抑癌基因let-7α的表達

8、增加18倍，阻礙TGFβ引起的原癌基因181α表達的增加，從而阻滯EMT相關的乳腺癌細胞的自我更新。二甲雙胍降低乳腺癌組織內腫瘤干細胞標志CD24的表達，而CD24可以促進腫瘤細胞的轉移。卵巢癌及肺癌的研究提示:二甲雙胍在抑制腫瘤組織生長、血管生成及轉移方面與化療藥物順鉑具有協(xié)同作用。5-氟尿嘧啶(5-FU)是結直腸癌的常規(guī)化療藥物，由于它療效確切，一直處于其他化療藥無法替代的地位，但一些結直腸癌病例對5-FU為主的化療并不敏感，其對5

9、-FU單藥治療的有效率僅為20％。研究發(fā)現(xiàn)，對5-FU耐藥的細胞多屬于腫瘤干細胞群。二甲雙胍對結直腸癌干細胞是否具有特異性殺傷作用，與結直腸癌的常規(guī)化療藥物5-FU之間是否具有協(xié)同作用，能否改善5-FU耐藥，降低5-FU的使用劑量，尚未見相關文獻報道。CD133是結直腸癌干細胞標志之一。2007年，O'Brien CA等在裸鼠體內運用腎被膜移植實驗鑒定了人類直腸癌的起始細胞(CC-IC)。純化實驗證實所有的CC-ICs均為CD133+細

10、胞，CD133-細胞組成腫瘤的主要部分但不能促進腫瘤生長。通過有限稀釋法發(fā)現(xiàn):CD133+細胞中起始細胞的含量是整個腫瘤細胞中起始細胞含量的200倍。在CD133+細胞群中的CC-ICs在連續(xù)的移植中能維持生長、分化以及重建腫瘤的異質性。Wnt/β-catenin信號通路與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤細胞耐藥性的產生密切相關。腫瘤干細胞內，Wnt/β-catenin通路活化，細胞內β-catenin蛋白表達增加。Wnt/β-caten

11、in通路主要由細胞外因子(Wnt)、跨膜受體(frizzled)、胞質蛋白(β-catenin)及核內轉錄因子(TCF)等一系列蛋白組成。細胞外因子與受體結合后，通過一系列胞質蛋白間的相互作用，使得細胞漿內β-catenin蛋白含量增加，進入細胞核，與細胞核內的轉錄因子TCF結合，兩者共同作用激活一系列的下游靶基因，包括cylinD1、c-myc等的轉錄，這些靶基因多數(shù)是與細胞增殖及凋亡相關的基因。結腸癌組織中，CD133陽性表達和Wn

12、t/β-catenin通路激活提示腫瘤細胞耐藥，預后不良，可以作為腫瘤干細胞的標記。在成骨細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠促進β-catenin蛋白的磷酸化降解，降低細胞內β-catenin蛋白的水平，進而抑制Wnt/β-catenin通路活性?；加薪Y直腸癌的糖尿病患者，在結直腸癌術后口服二甲雙胍與其它降糖方案相比，總的死亡率及結直腸癌相關的死亡率均顯著降低，我們推測，可能與二甲雙胍能夠特異性的抑制結直腸癌干細胞生長，從而抑制了結直腸癌的

13、復發(fā)和轉移相關。本實驗通過對南方醫(yī)院2010年1月-2012年6月期間住院的2型糖尿病合并結直腸癌患者的臨床資料進行回顧性分析，探討了2型糖尿病與結直腸癌的關系以及不同降糖方案對結直腸癌分化程度以及轉移的影響;免疫組化檢測了使用二甲雙胍降糖的2型糖尿病合并結直腸癌患者與未使用二甲雙胍的患者相比，手術切除的結直腸癌腫瘤組織內CD133及β-catenin蛋白表達的差異，探討了二甲雙胍是否對結直腸癌干細胞也具有一定的殺傷作用;細胞學實驗檢測

14、了二甲雙胍預處理能否夠增強常規(guī)化療藥物5-FU對結腸癌細胞SW620的抑制作用及其可能機制，從而為二甲雙胍應用于結直腸癌的預防和治療提供一定的理論依據(jù)。本研究分為三個部分：
　　 第一章：2型糖尿病合并結直腸癌患者的臨床特點。
　　 目的：探討2型糖尿病合并結直腸癌患者的臨床病理特征及降糖藥物二甲雙胍對腫瘤分化程度及轉移的影響。
　　 方法：⑴采用統(tǒng)一的調查表，記錄南方醫(yī)院2010-1-1至2012-6-30期間

15、住院治療的病案資料齊全的2型糖尿病合并結直腸癌患者的臨床資料，病例共計187例，其中男性患者107例，女性患者80例。⑵調查表的主要內容包括:性別、年齡、2型糖尿病病程、體重指數(shù)(BMI)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、尿素氮（BUN）、肌酐(CR)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、降糖藥的

16、使用情況，結直腸癌病理分級、結直腸癌淋巴結及遠處轉移情況等。⑶采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對實驗結果及臨床資料進行統(tǒng)計分析，總結結腸癌合并糖尿病患者的臨床特點，計量資料用x±sd表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗;計數(shù)資料用百分數(shù)(％)表示，采用X2檢驗;P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：①187例2型糖尿病合并結直腸癌患者的平均年齡為63.24±11.29歲，平均糖尿病病程為5.25±5.36年，發(fā)現(xiàn)結腸癌時才診斷糖

17、尿病的患者占47.06％，患者臨床計量資料的單樣本t檢驗顯示，除外FBG和HbA1c外，患者的其它資料基本在正常范圍內（95％可信區(qū)間）。②患者結直腸癌的病理類型以中分化腺癌為主，占51.34％，其次為高分腺癌(26.20％)，低分化腺癌(7.9％)，粘液腺癌(10.70％)。其它病理類型分別為:印戒細胞癌1例;管狀絨毛狀腺瘤，伴局部癌變1例;病理類型不詳伴廣泛轉移4例。③患者淋巴結轉移率為25.67％;肝轉移16例(8.56％);肺轉

18、移5例(2.67％);腹腔轉移5例(2.67％);盆腔轉移2例(1.07％);膀胱侵犯2例(1.07％)。④按照降糖藥物的使用情況，將患者分為二甲雙胍組和非二甲雙胍組，二甲雙胍組患者低分化腺癌比例及遠處轉移率均顯著低于非二甲雙胍組，提示二甲雙胍組患者結直腸癌的預后較好。
　　 結論：⑴2型糖尿病合并結直腸癌患者，占同期南方醫(yī)院住院的結直腸癌患者的12.74％，其中，高達47.06％的患者是在已經診斷結直腸癌的基礎上，入院常規(guī)檢查

19、時才診斷了2型糖尿病，與我國糖尿病患病率高、檢出率低的現(xiàn)狀是相符合的。患者空腹血糖的平均水平為（9.27±2.58）mmol/L，糖化血紅蛋白的平均水平為（7.25±1.65）％，血糖控制差，不利于腫瘤的治療。⑵研究中的187例2型糖尿病合并結直腸癌患者，初診結直腸癌時已經合并遠處轉移者為29例，占15.51％，遠處轉移率高，預后差;⑶二甲雙胍組與非二甲雙胍組患者相比，二甲雙胍組患者結直腸癌中低分化腺癌比例、遠處轉移率均低于非二甲雙胍組

20、，提示二甲雙胍組患者結直腸癌的預后較好。
　　 第二章：二甲雙胍對結直腸癌組織中CD133及β-catenin蛋白表達的影響。
　　 目的：探討二甲雙胍對結腸癌組織中復發(fā)和轉移相關的蛋白質CD133及1β-catenin表達的影響。
　　 方法：⑴以2010年1月至2012年6月南方醫(yī)院普外科住院的2型糖尿病合并結腸癌患者手術切除的腫瘤組織為研究對象，其中二甲雙胍組19例（組織病理分級為:高分化者3例，中分化者1

21、5例，低分化者1例），非二甲雙胍組18例（組織病理分級為:高分化者4例，中分化者11例，低分化者3例）。⑵免疫組織化學方法觀察兩組標本中CD133及β-catenin蛋白表達的差異。⑶采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行X2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：①二甲雙胍組患者結直腸癌組織中CD133蛋白陽性表達率為21.1％(4/19)，非二甲雙胍組陽性表達率為50％(9/18)。非二甲雙胍組CD133陽性表達率

22、高于二甲雙胍組，但是差異無統(tǒng)計學意義(P=0.065)。②二甲雙胍組患者結直腸癌組織中β-catenin蛋白陽性表達率為36.8％(7/19)，非二甲雙胍組陽性表達率為72.2％(13/18)，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.031)。
　　 結論：⑴二甲雙胍組與非二甲雙胍組患者相比，二甲雙胍組患者結直腸癌組織中CD133及β-catenin蛋白的陽性表達率均低于非二甲雙胍組，可能是二甲雙胍改善結直腸癌患者預后的機制之一。⑵術

23、前未進行放化療的2型糖尿病合并結直腸癌患者手術標本數(shù)量有限，本研究具有一定的局限性，有待進一步擴大樣本量深入探討。
　　 第三章：二甲雙胍預處理對5-氟尿嘧啶抑制人結腸癌細胞SW620增殖的影響及其機制。
　　 目的：探討二甲雙胍預處理能否增強化療藥物5-FU對人結腸癌細胞SW620的抑制作用及其可能機制。
　　 方法：⑴以人結腸癌株SW620為實驗對象。采用含10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于

24、37℃、5％ CO2的培養(yǎng)箱內。⑵MTT法測定各組細胞的增殖能力。⑶流式細胞儀檢測細胞周期、細胞凋亡以及CD133+細胞比例。⑷免疫印跡法(Western Blot)檢測各組細胞總蛋白及細胞核蛋白內β-catenin蛋白的表達水平。⑸采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行處理，各指標數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差((x)±sd)表示，各組均數(shù)比較采用方差分析，方差齊時，多重比較采用LSD法(Least-significant difference te

25、st)檢測，方差不齊時，多重比較采用Tambane'sT2法檢測。P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：①MTT法觀察三種細胞的增殖情況:24 h，5-FU組細胞的OD值與MET+5-FU組相比差異沒有統(tǒng)計學意義;48h和72 h，5-FU組細胞的OD值低于MET+5-FU組，兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。②正常對照組、5-FU組、MET+5-FU組細胞周期S期細胞比例分別為(43.06±2.75)％

26、;(39.62±0.88)％;(24.14±6.01)％，三組細胞間的差異具有統(tǒng)計學意義(F=20.562，P=0.002)，MET+5-FU組S期細胞比例顯著低于5-FU組(P=0.003)。③正常對照組、5-FU組、MET+5-FU組細胞早期凋亡率分別為(1.333±0.351)％，(1.767±0.611)％，(3.500±1.082)％，三組細胞早期凋亡率的差異具有統(tǒng)計學意義(F=7.098，P=0.026)，SW620組與5-

27、FU組相比差異不具有統(tǒng)計學意義(P=0.503)，5-FU組與MET+5-FU組相比具有顯著差異(P=0.029);④正常對照組、5-FU組、MET+5-FU組細胞晚期凋亡率分別為(3.667±0.252)％，(9.467±2.003)％，(18.233±1.159)％，三組細胞晚期凋亡率的差異具有統(tǒng)計學意義(F=81.728，P=0.006)，各組間的差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。⑤正常對照組、5-FU組、MET+5-FU組細

28、胞內CD133+細胞比例分別為(27.63±2.58)％，(21.30±1.40)％，(15.13±3.43)％，三組細胞間CD133+細胞比例的差異具有統(tǒng)計學意義(F=17.254，P=0.003)，各組間的差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。⑥正常對照組、5-FU組、MET+5-FU組細胞總蛋白內β-catenin蛋白的相對表達量分別為0.936±0.005，0.884±0.017，0.463±0.061，三組細胞總蛋白中β-ca

29、tenin蛋白表達量的差異具有統(tǒng)計學意義(F=82.531，P=0.000);⑦正常對照組、5-FU組、MET+5-FU組細胞核蛋白內β-catenin蛋白的相對表達量分別為1.890±0.242，1.760±0.342，1.163±0.242，三組細胞核蛋白中β-catenin蛋白表達量的差異具有統(tǒng)計學意義（F=5.774，P=0.040）;⑧MET+5-FU組細胞總蛋白及細胞核蛋白內β-catenin蛋白的表達均顯著低于5-FU組(

30、P＜0.05)，5-FU組與SW620組之間的差異均不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論：⑴二甲雙胍預處理增強了5-FU對結腸癌細胞SW620增殖的抑制作用，細胞周期S期細胞比例顯著降低，細胞凋亡率增加。⑵二甲雙胍預處理增強了5-FU對結腸癌細胞SW620中CD133+細胞的殺傷作用，抑制了細胞內Wnt/β-catenin通路活性。⑶二甲雙胍與結直腸癌常規(guī)化療藥物5-FU具有協(xié)同作用，有可能作為一種新的輔助治療方式，提