1、背景
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone mesenchymal stem cells,hMSC)是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞,目前已有越來越多的國內(nèi)外研究證明從骨髓組織中提取的間充質(zhì)干細(xì)胞在不同體外環(huán)境誘導(dǎo)下可以向其他多種組織細(xì)胞分化可以分化為具有中胚層[1,2]、外胚層[3,4]和內(nèi)胚層[5]特點(diǎn)的細(xì)胞,包括成骨細(xì)胞[6]、軟骨細(xì)胞[7]、心肌細(xì)胞[8]、以及神經(jīng)細(xì)胞[9,10]等。盡管目前對h

2、MSC的分化機(jī)制的研究尚未有定論,但是已有足夠相關(guān)研究證明hMSC還能跨胚層向表皮細(xì)胞[11]和內(nèi)皮細(xì)胞[12]等來源于其它胚層的細(xì)胞分化。這也擴(kuò)展了hMSC在醫(yī)學(xué)和研究領(lǐng)域的應(yīng)用前景。除此以外,hMSC還具有多方面的效能,包括調(diào)節(jié)造血功能,在創(chuàng)面愈合過程中分泌因子抑制細(xì)胞凋亡并激活內(nèi)源性細(xì)胞的修復(fù)作用,以及控制炎癥和免疫反應(yīng)等[13]。因此,hMSC的研究是近年來基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究關(guān)注的熱點(diǎn)。然而目前在hMSC相關(guān)研究中仍存在許多

3、重要的科學(xué)問題亟待解決。特別是hMSC在體外的生物學(xué)特性研究至關(guān)重要,是其基礎(chǔ)和應(yīng)用研究的前提。
　　 蛻皮甾酮(ecdysterone,B-ecdysone,EDS亦稱β-蛻皮激素,簡稱蛻皮素)屬于昆蟲生長代謝調(diào)節(jié)激素,最早為昆蟲學(xué)家所研究。昆蟲、甲殼動物及其它節(jié)肢動物具有韌硬的角質(zhì)層外殼,定期分泌蛻皮激素將角質(zhì)層外殼淘汰并代之以新的一層,這個過程就謂之蛻皮或蛻皮作用。但人們發(fā)現(xiàn),蛻皮激素在植物界的分布不僅較動物界廣,而且含量

4、較高,資源豐富,迄今還不斷地在植物界發(fā)現(xiàn)昆蟲蛻皮甾酮類物質(zhì),這類植物源蛻皮甾酮已近160個。目前蛻皮激素的應(yīng)用仍依賴于從植物中提取。蛻皮甾酮在脊椎動物中也是必需的物質(zhì)。其對機(jī)體以下功能影響較大,目前所知其作用機(jī)理主要為:1)、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成；2)、調(diào)節(jié)糖代謝；3)、調(diào)節(jié)脂代謝；4)、調(diào)節(jié)基因表達(dá)；5)、改善免疫功能:6)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用；7)、作用于心血管系統(tǒng)；8)、促進(jìn)愈合作用等[14]。
　　 體外培養(yǎng)的研究表明,EDS能

5、促進(jìn)人表皮細(xì)胞的分化[15],而其同為類固醇的地塞米松已被證實(shí)可促進(jìn)MSC分化為骨組織。在本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn),蛻皮甾酮有刺激人奇靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分裂[16],降低肺血管通透性[17]和有效促進(jìn)兔皮膚缺損創(chuàng)傷愈合過程[18],促進(jìn)表皮干細(xì)胞[19]的增殖等作用。同時其有刺激細(xì)胞增殖,對抗炎性反應(yīng)的作用。因其在自然界中的廣泛存在,它是中藥牛膝等植物的重要組成,易于分離提取。蛻皮甾酮的生物多效性提示其對促進(jìn)細(xì)胞的增殖以及干細(xì)胞誘導(dǎo)分

6、化等方面有一定的影響,進(jìn)行此項研究具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 第一部分:人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和鑒定
　　 目的
　　 分離培養(yǎng)并鑒定人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。為實(shí)驗(yàn)的后續(xù)步驟提供種子細(xì)胞。
　　 方法
　　 采用密度梯度離心法,分離含有間充質(zhì)干細(xì)胞的人骨髓細(xì)胞懸液,獲得人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測第2代培養(yǎng)的細(xì)胞CD44、CD105、CD34及CD29的表達(dá)以鑒定其為hMSC。流式

7、細(xì)胞儀檢測第3代hMSC細(xì)胞表面標(biāo)記CD44、CD105和CD34。培養(yǎng)擴(kuò)增。經(jīng)傳代、擴(kuò)增、純化,取第3、5、10、代hMSC細(xì)胞,觀察細(xì)胞生長特性并記錄hMSCs生長曲線。
　　 結(jié)果
　　 1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察:倒置顯微鏡下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種12h即貼壁,原代和傳代細(xì)胞呈梭形外觀,去除懸浮細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)3 d貼壁細(xì)胞開始增殖,伸展為短梭型、多角型及不規(guī)則型等。培養(yǎng)7-8d形成集落的數(shù)目、大小明顯增加,

8、細(xì)胞排列有一定的方向性,至14 d細(xì)胞密集在集落中心,基本鋪滿瓶底。
　　 2.免疫組化:細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD29,CD105陽性,CD34陰性。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測:CD34陽性率為1.64％、CD44陽性率為92.61％；CD105陽性率為91.77％。
　　 4.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線:細(xì)胞傳代后3 d內(nèi)處于潛伏期,3 d后進(jìn)入生長期,7 d后進(jìn)入平臺期。
　　 結(jié)論
　　

9、 1、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在體外分離、純化培養(yǎng),生長穩(wěn)定、可連續(xù)傳代。
　　 2、經(jīng)細(xì)胞免疫組化和流式細(xì)胞儀鑒定,培養(yǎng)的細(xì)胞不是骨髓中的造血干細(xì)胞或骨髓基質(zhì)中的成纖維細(xì)胞,是處于未分化階段的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 3、人間充質(zhì)干細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加增殖能力有逐漸降低的趨勢。
　　 第二部分:不同濃度蛻皮甾酮對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響
　　 目的
　　 觀察蛻皮甾酮(Ecdysterone,

10、EDS)對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human marrowmesenchymal stem cells,hMSC)增殖的影響。并明確蛻皮甾酮促hMSC增殖的最佳有效濃度。
　　 方法
　　 設(shè)定不同終濃度EDS的細(xì)胞培養(yǎng)體系(10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)與對照組(單純hMSC培養(yǎng)基EDS濃度0μg/ml)作對比,在不同的時間點(diǎn)用MTT比色法測定hMSC細(xì)胞的增殖活力,檢測不同濃度EDS的

11、細(xì)胞培養(yǎng)體系中hMSC的生長曲線,并行流式細(xì)胞周期觀察增殖期細(xì)胞所占比例。對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果
　　 1.在培養(yǎng)體系中EDS各濃度組hMSC的M1Yr吸光度值與對照組均有顯著差異(采用重復(fù)測量資料的方差分析P<0.01)；其中EDS濃度為25μg/ml時hMSC培養(yǎng)體細(xì)胞MTT吸光度值顯著高于其余各組(P<0.01 SPSS軟件分析)；在EDS濃度為10μg/mL、50μg/mL、100μg/ml時,三組間

12、吸光度值未見顯著差異(P>0.05),三組相應(yīng)吸光度值較25μg/ml組稍減低,但吸光度值顯著高于對照組(P<0.01)。
　　 2.hMSC生長曲線提示EDS濃度為251μg/ml時細(xì)胞的增殖能力較其他各組細(xì)胞有顯著提高,而不同EDS濃度培養(yǎng)組hMSC增殖能力高于空白對照組。
　　 3.流式細(xì)胞周期顯示:EDS濃度為25μg/ml時hMSC培養(yǎng)體細(xì)胞S期細(xì)胞所占比例,同時EDS濃度為25μg/ml時hMSC培養(yǎng)體細(xì)胞的

13、增殖指數(shù)也顯著高于對照組。
　　 結(jié)論
　　 EDS在一定濃度范圍內(nèi)對體外培養(yǎng)條件下的hMSC具有生長促進(jìn)作用,該作用在EDS濃度為25gμg/mL時最為顯著。但是EDS促進(jìn)hMSC增殖的作用不隨劑量的增加而增加。
　　 目的
　　 觀察蛻皮甾酮(Ecdysterone,EDS)對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human marrowmesenchymal stem cells,hMSC)分化的影響。
　　

14、 方法
　　 25μg/ml濃度EDS的細(xì)胞培養(yǎng)體系(hMSC培養(yǎng)基+25μg/ml EDS)作為實(shí)驗(yàn)組與空對照組(單純hMSC培養(yǎng)基EDS濃度0ug/ml)作對比。在培養(yǎng)20d時運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測CKl9,CK10。并運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測CK19的陽性率,觀察EDS對于MSC分化為表皮細(xì)胞的影響。同時在培養(yǎng)20d通過茜素紅染色觀察鈣化結(jié)節(jié)形成能力。觀察EDS對于MSC分化為成骨細(xì)胞的影響。
　　 結(jié)果
　　

15、 1.免疫組化顯示:實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞表面標(biāo)記物CK19,CK10陰性。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測:實(shí)驗(yàn)組陽性率CK19為1.64％、對照組CK19陽性率為92.61％；
　　 3.鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色顯示:EDS實(shí)驗(yàn)組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形成鈣化結(jié)節(jié)而對照組并未未形成。
　　 結(jié)論
　　 1.25μg/ml濃度的EDS不具有使人骨髓干細(xì)胞向表皮樣細(xì)胞分化的能力。
　　 2.EDS對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成