1、研究背景:
　　類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主的慢性高致殘性自身免疫性疾病。其病理特征為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥，以及由此導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨及骨的破壞。目前RA的治療藥物主要包括:非甾體抗炎藥(Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs，NSAIDs)，緩解病情抗風(fēng)濕藥（disease-modifying antirheumatic drugs，DMARD

2、s）以及近二十年來(lái)出現(xiàn)的生物制劑。臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)，雖然經(jīng)過(guò)正規(guī)早期聯(lián)合多種DMARDs藥物治療，仍有部分RA患者療效不佳;或者隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物療效逐漸減弱，患者對(duì)治療藥物無(wú)反應(yīng)或低反應(yīng)。這些現(xiàn)象的發(fā)生被認(rèn)為與多藥耐藥(Multiple DrugResistance，MDR)的形成有關(guān)。MDR現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)在腫瘤性疾病中，并且已經(jīng)有了較深入的認(rèn)識(shí)。而它在RA等自身免疫性疾病中的研究才剛剛起步，其具體機(jī)制尚不明確。
　　目前國(guó)內(nèi)外

3、研究證實(shí)，MDR的一個(gè)重要機(jī)制是跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物排出增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低。而P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是其中最重要的一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它的作用底物非常廣泛，除了抗腫瘤藥物、抗生素類(lèi)藥物之外，還包括多種DMARDs藥物。國(guó)外的研究和我們之前的研究顯示在耐藥的RA患者的滑膜組織和外周血淋巴細(xì)胞中P-gp的表達(dá)明顯增高，提示P-gp參與了RA的耐藥。而P-gp由多藥耐藥基因-1(Multidrug resi

4、stancegene-1，MDR-1)所編碼。我們猜測(cè)MDR1基因的突變或者其表達(dá)水平的改變可能會(huì)通過(guò)影響P-gp的表達(dá)及活性改變疾病對(duì)藥物的反應(yīng)性。因此，我們從MDR1基因入手研究其與RA中多藥耐藥的關(guān)系。
　　第一章:MDR1基因多態(tài)性與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎多藥耐藥的相關(guān)性研究
　　目的:探討我國(guó)湖南地區(qū)漢族人群MDR1基因多態(tài)性與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)多藥耐藥的相關(guān)性。
　　方法:

5、收集來(lái)自湖南地區(qū)204例使用兩種以上緩解病情抗風(fēng)濕藥(disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs)治療半年以上的RA患者以及104例正常對(duì)照的外周血，其中204例RA患者根據(jù)美國(guó)ACR20緩解標(biāo)準(zhǔn)將其分為兩組:112例治療有效組和92例耐藥組。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)檢測(cè)兩組RA患者以及正常對(duì)照組MDR1基因G2677T/A和C1236T位點(diǎn)的多態(tài)性。

6、
　　結(jié)果:
　　1.G2677T/A和C1236T基因型及等位基因的分布頻率在正常人和RA治療有效組之間均無(wú)明顯差異(P＞0.05);
　　2.與RA治療有效組相比，RA耐藥組中攜帶2677TT基因型的患者較少(P=0.014);
　　3.C1236T基因型及等位基因的分布頻率在RA治療有效組及RA耐藥組中間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.在湖南地區(qū)漢族人群中，MDR1基因G267

7、7T/A和C1236T位點(diǎn)的多態(tài)性與RA易感性無(wú)明顯關(guān)聯(lián);
　　2.在湖南地區(qū)漢族人群中，耐藥的RA患者中攜帶MDR12677TT基因型的人數(shù)明顯少于治療有效的RA患者，提示2677TT基因型可能是RA治療中藥物耐藥的保護(hù)因素。
　　3.在湖南地區(qū)漢族人群中，MDR1基因C1236T位點(diǎn)的多態(tài)性與RA的多藥耐藥無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。
　　第二章:MDR1基因高表達(dá)與RA多藥耐藥的相關(guān)性研究
　　目的:體外模擬高表達(dá)MDR1

8、的人RA滑膜耐藥細(xì)胞模型RA/MDR1，進(jìn)一步深入探討MDR1介導(dǎo)的RA中多藥耐藥的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.體外利用重組腺病毒Ad-EGFP-MDR1感染人RA滑膜細(xì)胞，獲得RA/MDR1細(xì)胞。
　　2.利用Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)RA/MDR1細(xì)胞MDR1基因轉(zhuǎn)錄水平及其編碼產(chǎn)物P-gp蛋白的表達(dá)水平。
　　3.采用羅丹明123外排實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RA/MDR1細(xì)胞外排羅丹明1

9、23功能，MTT法檢測(cè)RA/MDR1細(xì)胞對(duì)甲氨蝶呤(MTX)的耐藥性。
　　結(jié)果:
　　1.RA滑膜細(xì)胞感染重組腺病毒Ad-EGFP-MDR172小時(shí)后，可見(jiàn)RA/MDR1細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，細(xì)胞體積變大，生長(zhǎng)速度變慢，熒光下可見(jiàn)明顯綠色熒光出現(xiàn)，感染率大于90％。
　　2.Real-time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)于陰性病毒對(duì)照組細(xì)胞，RA/MDR1細(xì)胞MDR1的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平均有顯著

10、增加(p＜0.01; p＜0.05)。
　　3.RA/MDR1細(xì)胞外排羅丹明123能力較陰性病毒對(duì)照組細(xì)胞明顯增強(qiáng)(p＜0.01); MTX各個(gè)濃度對(duì)RA/MDR1細(xì)胞的抑制率均低于對(duì)陰性病毒對(duì)照組細(xì)胞(p＜0.05或p＜0.01)，且RA/MDR1細(xì)胞對(duì)MTX的耐藥性增加了37.36倍。
　　結(jié)論:體外成功模擬高表達(dá)MDR1的人RA滑膜耐藥細(xì)胞模型——RMMDR1;MDR1高表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)P-gp的表達(dá)影響RA滑膜細(xì)胞對(duì)