1、Kazal型蛋白酶抑制劑屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族,廣泛分布在大多數(shù)的生物體中,參與調節(jié)生物的免疫防御,血液凝集和纖維蛋白水解,以及發(fā)育,生殖等生理過程。目前已有大量的Kazal型蛋白酶抑制劑被分離純化,它們的結構和功能被報道。研究表明,典型的Kazal型結構域由50-60個氨基酸殘基組成,其中六個半胱氨酸殘基,以1-5/2-4/3-6的模式形成三對二硫鍵。在第二個半胱氨酸殘基之后的第二個氨基酸位點被稱為P1位點,此氨基酸則被稱為P1殘

2、基。這一家族的蛋白酶抑制劑在空間結構上具有顯著的特點,由一個緊密的支架和一個呈球狀突起的結合環(huán)構成。P1氨基酸殘基和結合環(huán)在很大程度上決定著抑制劑的抑制特性。Kazal型蛋白酶抑制劑的抑制機理屬于“標準型作用機理”,當抑制劑和蛋白酶相互作用時,P1殘基插入到蛋白酶的活性位點,結合環(huán)上的其他殘基則通過不同的分子作用力影響兩者結合。 在我們實驗室原先的研究中,一種雄性生殖道相關的蛋白酶抑制劑(MRPINK)基因從羅氏沼蝦中被克隆出來

3、。該基因包含405bp的編碼區(qū),由21個氨基酸的信號肽和113個氨基酸的成熟肽鏈組成,構成兩個Kazal型結構域。其特異性地在雄性生殖道中表達,并且被具體定位在生殖道中的分泌型上皮細胞。 在本研究中,我們對MRPINK和它的幾個突變體成功地進行了原核表達,檢測了它們對三種絲氨酸蛋白酶的抑制活性,分析了MRPINK的抑制特征和抑制機理,以及MRPINK兩個結構域和P1氨基酸殘基對抑制劑活性的影響。同時我們還研究了MRPINK對羅氏

4、沼蝦精子活性的影響,以闡述這個抑制劑分子的生理功能。實驗結果如下： 1.MRPINK和針對P1位點構建的幾個突變體(MRPINK137K,MRPINKL37A,MRPINKL37G,MRPINKP881)通過pET-28a(+)載體被成功地在大腸桿菌中進行了誘導表達；同時MRPINK的兩個結構域domain1和domain2通過pET-32a(+)載體也被在大腸桿菌中成功地誘導表達。其中rMRPINK,rMRPINKL37K,r

5、MRPINK37A,rMRPINKL37G,和rMRPINKP881以包涵體的形式被表達；而domain1和domain2則以可溶性的形式被表達。根據(jù)不同的性質,這些重組蛋白通過Ni-NTA,分別在變性條件和非變性條件下被分離純化。 2.通過分析重組蛋白對三種蛋白酶(Trypsin,Chymotrypsin,Thrombin)的抑制活性,表明MRPINK特異性地抑制chymotrypsin的活性,而對其它的兩種蛋白酶沒有抑制作用

6、。進一步發(fā)現(xiàn),MRPINK對chymotrypsin是一種典型的競爭性抑制,抑制常數(shù)K1為354nM。其中domain2是具有抑制功能的結構域,抑制常數(shù)K1為416nM。P1 Pro對domain2的抑制活性發(fā)揮著關鍵性的作用。而對于domainl來說,不管P1位點為Leu,Lys,Ala或者是Gly均沒有表現(xiàn)出抑制活性。 3.我們進一步研究了rMRPINK對羅氏沼蝦精子活性的抑制作用。結果發(fā)現(xiàn)精子提取物對卵膜蛋白的水解作用能夠

7、被MRPINK所抑制；明膠薄層(gelatinsubstrate film)分析顯示,MRPINK對羅氏沼蝦精子的水解明膠活性具有明顯的抑制作用；通過免疫熒光分析揭示,MRPINK特異性地結合在精子的基體(base)邊緣部位。 4.我們將羅氏沼蝦精子上的一種能夠被MRPINK特異性抑制的類明膠酶命名為羅氏沼蝦精子明膠酶(MSG,M.roseabergii sperm gelatinase)。應用HPLC(reversed-pha

8、se high performance liquid chroma tography)和明膠-SDS-PAGE分析,MSG被分離純化。通過氨基末端氨基酸測序分析和分子克隆,MSG的cDNA序列被揭示。Northern blotting結果表明,MSG在羅氏沼蝦雄性生殖道中特異性地表達。原位雜交(ISH)實驗進一步表明,MSG在羅氏沼蝦的輸精管和壺腹上皮分泌型細胞中表達。 結果表明,MRPINK競爭性地抑制chymotrypsin