1、目的:烯醇化酶(Enolase，2-phospho-D-glycerate hydrolyase，ENO)是糖酵解途徑的一個關鍵酶，催化2-磷酸甘油酯(2-PGA)至磷酸烯醇式丙酮酸酯的脫水反應;同樣，它也可催化糖異生中的逆反應。它廣泛存在，包括細菌、真菌、果蠅、兩棲類、鳥類、植物和人類等;是白念珠菌中含量最為豐富的蛋白之一。白念珠菌基因組DNA中含有一個或兩個ENO編碼基因，克隆的cDNA有一連續(xù)的開放讀碼框架，含1320bp，編碼4

2、40個氨基酸，與釀酒酵母(S.cerevisiae) ENO蛋白1和2的同源性分別為76％和78％，與人類ENO有60％同源性，預測蛋白分子量47，178Da，等電點5.6。根據體外實驗研究人們推測:在白念珠菌侵入宿主組織和擴散的過程中，白念珠菌ENO同樣可作為纖溶酶原等的受體，產生纖溶酶，促進細胞基質降解，破壞細胞自然屏障，促進菌體穿過和損壞上皮細胞、內皮細胞，促進白念珠菌在組織、器官中擴散。由于烯醇化酶缺乏N段分泌信號，其存在菌體外

3、部一直存在爭議。應用免疫電鏡方法分析體外培養(yǎng)的白念珠菌，顯示:ENO存在于白念珠菌酵母相和菌絲相的胞漿和細胞壁。迄今為止，國內外對白念珠菌ENO的定位特征研究，以體外實驗為主。念珠菌在深部組織器官感染過程中，其ENO的定位特征如何，至今未見文獻報道。觀察感染深部組織的念珠菌ENO細胞定位特征對我們更好地理解ENO在念珠菌侵襲深部組織中的作用機制具有重要的意義。因此，本研究通過應用釀酒酵母ENO建立抗白念珠菌ENO單克隆抗體，應用免疫組化

4、方法分析深部感染組織中念珠菌ENO的定位特征。
　　 方法:
　　 1.ENO抗體的制備:ENO（來自釀酒酵母，Sigma產品）作為抗原與福氏完全佐劑充分混勻，免疫BALB/c小鼠，取脾細胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細胞融合。選出陽性克隆，再進行亞克隆，將穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細胞株擴大培養(yǎng)，鑒定效價。取一定量雜交瘤細胞給BALB/c小鼠腹腔注射，約兩周后收集腹水。獲得相應的IgG，進行抗體效價、亞類和特異性鑒定。
　　

5、 2.建立系統(tǒng)念珠菌感染BALB/C小鼠模型:應用環(huán)磷酰胺經腹腔注射BALB/C小鼠。注射藥物后第4日，經腹腔注射白念珠菌SC5314菌株孢子，觀察小鼠不同時間血液常規(guī)、腎臟真菌載量和心、肺、腎、腦、肝、脾等重要組織病理變化。
　　 3.體外培養(yǎng)白念珠菌的ENO表達定位特征:采用免疫組化法，用所制備的抗ENO單克隆抗體對體外培養(yǎng)的白念珠菌石蠟包埋組織進行預試驗。確定免疫組化法實驗條件，并分析ENO的表達定位特點。
　　

6、 4.重要組織感染白念珠菌的ENO表達定位特征:采用免疫組化法，用所制備的抗ENO單克隆抗體，對系統(tǒng)念珠菌感染BALB/C小鼠模型的心、肺、腎、腦、肝、脾等重要組織石蠟包埋組織;和肺活檢組織白念珠菌培養(yǎng)陽性、影像學證據支持的人類肺念珠菌感染病例的組織石蠟包埋組織進行試驗。分析深部組織器官內白念珠菌ENO表達定位特點。
　　 結果:
　　 1.以釀酒酵母ENO為抗原，制備的抗ENO單克隆抗體19株，其中10E10株效價最高

7、，可達1(∶)4，096，000(ELISA)，并與天然白念珠菌ENO反應。
　　 2.ENO在體外培養(yǎng)白念珠菌胞漿內和胞壁都有表達存在，但以胞漿為主。
　　 3.ENO在系統(tǒng)念珠菌感染BALB/C小鼠模型的心、肺、腎、腦、肝、脾等重要組織的白念珠菌ENO在菌體胞漿內和胞壁都有表達存在，但以胞壁為主。特別是在與組織緊貼的念珠菌其ENO表達定位于胞壁，而聚集的念珠菌其ENO則表達定位于胞漿。在人類肺念珠菌病組織內白念珠菌E