1、流行性感冒病毒(influenza virus，簡稱流感病毒)是流行性感冒(influenza，簡稱流感)的病原體。流感一直是引起人類死亡的主要疾病之一，20世紀發(fā)生的4次全球性流感大流行給個人和社會造成無法估量的損失。而從1997年至今禽流感的肆虐更給人們敲醒了警鐘。流感病毒易突變，雖然目前科學技術突飛猛進，人類至今無法征服流感。高效及安全的疫苗接種是預防流感的有效手段。核酸疫苗作為第三代疫苗，與傳統(tǒng)的滅活及減毒疫苗相比，其操作簡單、

2、安全有效、可大規(guī)模生產并能同時誘導機體產生體液及細胞免疫，使之成為流感疫苗研究的熱點。 血凝素(haemmagglutinin，HA)和神經氨酸酶(neuraminidase，NA)是存在于流感病毒表面的兩種主要糖蛋白。HA可刺激機體產生中和抗體，是最主要的保護性抗體。與HA相比，NA的變異程度小，其刺激機體產生的抗體，在抑制病毒的感染中發(fā)揮著重要作用。目前廣泛應用的流感滅活疫苗主要由純化的流感病毒表面糖蛋白HA和NA構成，目的

3、在于誘導宿主機體產生抗-HA和抗-NA抗體。有研究表明，編碼HA或NA的核酸疫苗通過基因槍或肌肉注射可誘發(fā)動物產生特異性免疫應答，提供抗流感保護作用。陳則等用表達流感病毒的HA、NA、MI、NP、NSl基因的DNA疫苗分別免疫小鼠，結果發(fā)現(xiàn)只有免疫表達HA或NA的基因疫苗能夠抵抗致死量流感病毒的攻擊。同時還發(fā)現(xiàn)，將HA和NA DNA疫苗混合免疫小鼠能夠增強小鼠抵抗病毒攻擊的能力且抑制病毒在肺中的復制。進一步研究表明NA DNA疫苗免疫的

4、動物能夠抵抗同一亞型不同病毒株的攻擊而且在同一種屬不同種群個體間產生交叉免疫，HA DNA疫苗則有一定的種群局限性。因此，有學者建議：HA DNA和NA DNA疫苗聯(lián)合應用。 本研究在本室成功構建甲(A)型流感病毒A／PR／8／34(H1N1)的pcDNA3.1(+)／HA<,1>的基礎上，構建pcDNA3.1(+)／HA和pcDNA3.1(+)／2qA核酸疫苗并在細胞和機體水平上研究其單獨應用及聯(lián)合應用的表達及免疫效果。多個攜

5、帶不同基因的獨立載體系統(tǒng)同時轉染靶細胞，優(yōu)點是可以自由調節(jié)各表達載體的比例，但缺點是效率太低。低效的基因轉移過程是基因治療的瓶頸。構建多基因表達載體可提高轉移及表達效率。本課題還對多基因表達載體plRES2-EGFP進行改造，使其共表達HA和NA或HA<,1>和NA兩種蛋白，擬提高核酸疫苗轉移及表達效率，更好的發(fā)揮核酸疫苗的免疫效果。 方法： 1．甲(A)型流感病毒單基因真核表達DNA疫苗和多基因表達DNA疫苗的構

6、建： 利用RT-PCR．技術從流感病毒株A／PR／8／34(H1N1)感染的雞胚尿囊液中擴增HA、NA基因，克隆入真核表達載體pcDNA3.1(+)構建真核表達載體pcDNA3．1(+)／HA和pcDNA3．1(+)／NA。通過現(xiàn)代分子生物學技術改造真核表達載體plRES2-EGFP，構建多基因表達載體pHA-IRES2-NA和pHA<,l>-IRES2-NA。 2．重組DNA疫苗的表達： 重組DNA疫苗用脂質體介導法轉染H

7、EK293細胞，免疫熒光技術檢測重組質粒的表達情況。用G418篩選轉染后的抗性細胞，擴增幾代后借RT-PCR技術和序列分析對目的基因進行鑒定。重組疫苗經肌肉注射免疫動物，免疫組化技術檢測目的基因在肌細胞的表達及持續(xù)時間。加強免疫后一周，取實驗動物重要器官或組織制備組織切片，利用免疫組化技術初步了解目的蛋白從肌細胞向外分泌后，在機體其他組織器官表達的情況。 3．重組DNA疫苗的免疫效果研究： 將重組DNA疫苗肌肉注射免疫動物，利

8、用傳統(tǒng)的病毒學、血清學實驗技術和現(xiàn)代流式細胞技術相結合，研究其誘導機體的抗病毒效應及對機體體液和細胞免疫的影響，探討重組DNA疫苗的免疫效果。 結果： 1．經限制性內切酶酶切鑒定、RCR擴增及序列測定證實甲(A)流感病毒單基因真核表達載體和多基因表達載體構建成功。 2．免疫熒光組化技術顯示所構建的單基因真核表達載體和多基因表達載體轉染的部分細胞有較強的綠色熒光表達。實驗動物肌肉注射重組DNA疫苗后，目的蛋

9、白在肌肉細胞內表達可持續(xù)一段時間，所有重組質粒除4小時無表達或表達較弱外，其他時間點都可觀測到目的蛋白的表達。于加強免疫后一周，免疫組化技術檢測到目的蛋白可在肌肉、肺、腦等組織表達。 3．實驗結果顯示重組質粒皆可誘導CD8細胞數量百分比的增加，都在50％以上，遠高于PBS對照組(31.77％±2.99)。同時，重組質粒上調Thl和Th2細胞的比例(>0.8)，而PBS對照組低于0.5；再次免疫產生的抗體效價(1:20以上)，是

10、初次免疫應答(1:10以下)的2～3倍；被重組質粒免疫的動物可抵抗致死量的病毒攻擊，保護率在60％以上。 結論： 1．成功構建了甲(A)流感病毒單基因真核表達載體和多基因表達載體。 2．經免疫熒光技術及RT-PCR技術等證實了重組DNA疫苗能夠在哺乳動物細胞中正確表達。實驗動物肌肉注射重組DNA疫苗后可在肌細胞內檢測到目的基因表達。肌細胞表達的目的蛋白可向周圍分泌，轉運至其他組織。 3．重組DNA