1、目的：(1)了解膽汁對鼠傷寒沙門菌形成 L型的影響，建立鼠傷寒沙門菌L型的檢測方法。(2)了解豬膽囊攜帶鼠傷寒沙門菌L型的情況，探討膽囊攜帶鼠傷寒沙門菌L型的檢測方法。
　　方法:(1)將鼠傷寒沙門菌接種于豬膽汁內，37℃需氧培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1h~60d不同時間段取誘導物進行常規(guī)細菌學分離培養(yǎng)與鑒定。(2)同時取誘導物經(jīng)濾菌器濾過后接種于PG液進行細菌L型的非高滲分離培養(yǎng)，分離細菌L型的純培養(yǎng)物。觀察細菌L型的形態(tài)，培養(yǎng)特性，革蘭

2、染色，細胞壁染色，糖發(fā)酵試驗和血清學反應。(3)用檢測沙門菌屬特異性基因invA和鼠傷寒沙門菌特異性基因STM4495的二重PCR技術，對細菌L型進行檢測，并將擴增產物進行測序分析。(4)在貴陽市某屠宰場，采集284份豬膽囊標本（膽囊組織142份和膽汁142份），采用常規(guī)細菌學方法進行鼠傷寒沙門菌的分離培養(yǎng)和鑒定。(5)同時采用非高滲分離培養(yǎng)方法進行細菌 L型的分離培養(yǎng)，并用二重PCR檢測細菌L型分離株的invA和STM4495基因用于

3、鼠傷寒沙門菌L型的鑒定。將部分PCR陽性產物片段進行測序分析。
　　結果：(1)采用常規(guī)細菌學分離培養(yǎng)法從培養(yǎng)1h~60d的誘導物均可分離出細菌型，經(jīng)鑒定為鼠傷寒沙門菌。(2)同時經(jīng)非高滲分離培養(yǎng)檢出細菌L型。細菌L型呈圓球形或卵圓形，在血培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和LEM平板上不能生長，革蘭染色、細胞壁染色和血清學試驗均呈陰性，而糖發(fā)酵試驗結果無法判斷。(3)二重PCR檢測細菌L型invA和STM4495基因可見與鼠傷寒沙門菌細菌

4、型一致的284bp和915bp的擴增產物。將兩者擴增產物序列經(jīng)對比分析，發(fā)現(xiàn)其與GeneBank數(shù)據(jù)庫中公布的鼠傷寒沙門菌的一致性分別為100％和99%。(4)采用常規(guī)細菌學方法，從284份膽囊標本中，45份膽汁和104份膽囊組織檢出細菌，陽性率為52.46%（149/284）。經(jīng)革蘭染色和生化鑒定，檢出細菌17個種屬、共200株，包括革蘭陰性菌184株，革蘭陽性菌16株。革蘭陰性菌中檢出率最高是大腸埃希菌（32.75%,93/284）

5、，其他還包括氣單胞菌屬、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌、成團泛菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、遲鈍愛德華菌、假單胞菌屬、產堿桿菌屬、沙門菌屬、普通變形桿菌、巴斯德菌屬、肺炎克雷伯菌、異型枸櫞酸桿菌、產酸克雷伯菌。沙門菌經(jīng)血清學鑒定為4株科特布斯沙門菌和4株倫敦沙門菌。革蘭陽性菌均為鏈球菌屬（5.63%,16/284），以牛鏈球菌（81.25%,13/16）為主，余下為溫和鏈球菌。(5)采用非高滲分離培養(yǎng)法，90份膽汁和67份膽囊組織檢出細菌 L型，陽性

6、率為55.28%（157/284）。經(jīng)二重PCR檢測，9份膽囊標本（3份膽汁和6份膽囊組織）檢出沙門菌 L型，陽性率3.17%（9/284），其中4份檢出鼠傷寒沙門菌 L型，5份檢出其他沙門菌L型。在9份沙門菌L型陽性的標本中，5份膽囊標本（3份膽汁和2份膽囊組織）常規(guī)細菌學檢測呈陰性，但非高滲分離培養(yǎng)檢出2株鼠傷寒沙門L型和3株其他沙門L型。將部分invA和STM4495基因PCR產物片段進行測序分析，發(fā)現(xiàn)與 GeneBank數(shù)據(jù)庫中

7、鼠傷寒沙門菌的一致性均為99%。
　　結論：(1)鼠傷寒沙門菌在豬膽汁的作用下可發(fā)生細胞壁缺陷變異，成為L型;(2)常規(guī)細菌學方法不能用于鼠傷寒沙門菌穩(wěn)定 L型的分離培養(yǎng)與鑒定;(3)采用二重PCR技術檢測invA和STM4495基因，可鑒定鼠傷寒沙門菌的穩(wěn)定L型;(4)經(jīng)常規(guī)細菌學方法檢測，發(fā)現(xiàn)豬膽囊可攜帶沙門菌和多種其他細菌，主要為革蘭陰性細菌，以大腸埃希菌的檢出率最高;(5)膽囊內的鼠傷寒沙門菌L型，可采用非高滲分離培養(yǎng)法進