1、目的：機體天然免疫系統(tǒng)在抵御HIV感染中發(fā)揮重要作用，APOBEC3G(Apolipoprotein B mRNA-editing Enzyme，Catalytic Polypeptide-like3G)是新發(fā)現(xiàn)的細胞內天然免疫因子，具有抑制HIV Vif缺失病毒(HIV△vif)復制的能力。Vif(Virion Infectivity Factor)是HIV-1病毒的調節(jié)蛋白之一，以細胞依賴方式在新生病毒的組裝、釋放或者成熟階段增加其

2、感染性。體外實驗顯示，APOBEC3G通過誘導HIV△vif病毒逆轉錄過程中生成的cDNA，將胞嘧啶脫氨基轉變?yōu)槟蜞奏?，誘導病毒基因組DNA的致死性突變而抑制病毒復制。但當病毒Vif蛋白存在時，可通過阻止APOBEC3G組裝入病毒顆粒以及誘導泛素化降解等途徑來拮抗APOBEC3G。當Vif重要氨基酸位點發(fā)生改變時，其對APOBEC3G的降解作用明顯減弱或完全喪失。
　　 方法：
　　 1.研究對象
　　 由河南省

3、疾病預防與控制中心以及中國醫(yī)科大學艾滋病研究所艾滋病確認實驗室經Western blot試驗確認為陽性，未經抗病毒治療的HIV/AIDS患者。調查與采血前征得患者同意，并簽訂知情同意協(xié)議。患者血漿標本病毒核酸經套式聚合酶鏈反應擴增gag-pol區(qū)，序列測定和分析確定為B'亞型。根據HIV/AIDS患者感染時間和CD4+T細胞數(shù)量分為緩慢進展組(Slow Progressor，SP)：感染時間＞10年，未經抗病毒治療，CD4+T細胞數(shù)量＞

4、500個/μl；典型進展HIV組(HIV)：感染時間＞5年，CD4+T細胞數(shù)量介于200～500個/μl，無艾滋病指征性疾病；典型進展AIDS組(AIDS)：感染時間＞5年，CD4+T細胞數(shù)＜200個/μl，和/或合并艾滋病指征性疾病。HIV抗體陰性健康對照來自河南省。
　　 2.CD4+T淋巴細胞計數(shù)
　　 應用美國BECTON DICKINSON公司的流式細胞儀(FACSCALIBUR)測定CD4+、CD8+、CD3

5、+T淋巴細胞絕對值。將20μl CD4/CD8/CD3 TRITEST試劑加入CD4絕對計數(shù)管，加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACSMULTISET軟件檢測并進行自動分析。
　　 3.病毒載量測定
　　 用200μl病人血漿采用標準版模板制備法提取RNA，采用Roche公司HIV-1Monitor1.5 commercial kit在COBAS AMPLICOR自

6、動載量儀上以RT-PCR方法測定病毒載量。HIV病毒載量經log10對數(shù)轉化后用于統(tǒng)計分析。
　　 4.標準品質粒的構建
　　 取健康人EDTA抗凝全血5ml，常規(guī)提取外周血PBMC。采用Qiagen公司的RNeasy mini kit提取細胞總RNA。取1μg總RNA，按照Promega公司的ImProm-ⅡTMReverse Transcription System說明書逆轉錄合成cDNA。PCR擴增APOBEC3G

7、和GAPDH開放讀碼框架全長，PCR產物經回收純化后克隆到pGEM-T載體，轉化到DH5α感受態(tài)菌中，藍白篩選后獲得陽性克隆，測序驗證，純化重組質粒，紫外分光光度計定量后根據分子量換算為分子拷貝數(shù)，10倍系列稀釋質粒制備質粒標準品。
　　 5.實時定量PCR檢測APOBEC3G mRNA水平
　　 取健康對照和HIV感染者EDTA抗凝全血10ml，常規(guī)提取外周血PBMC。采用Qiagen公司的RNeasy mini ki

8、t提取細胞總RNA。選用Promega公司的ImProm-ⅡTM Reverse Transcription Systerm和隨機引物逆轉錄合成cDNA。APOBEC3G(NM021822)和內參GAPDH(NM002046.3)特異性探針序列為FAM-GCAACCAGGCTCCACATAAACACGG-NFQ；FAM-GGACTCATGACCACAGTCCATGCCA-NFQ。25μl實時PCR反應體系：2×TaqMan(R)Univ

9、ersal PCR Master Mix12.5μl，20×TaqMan Gene Expression Assay1.25μl、無RNase/DNase水9.25μl、cDNA2μl。應用ABI7500實時PCR儀進行檢測，反應條件50℃2 min，95℃10 min，95℃15 s、60℃1 min40循環(huán)。APOBEC3G和GAPDH mRNA絕對拷貝數(shù)由系列稀釋的質粒構建的標準曲線獲得，每份標本設2個復孔結果取均值。
　　

10、 6.Western blot方法檢測PBMC中APOBEC3G蛋白量
　　 將PBMC置于冰上，加入裂解液，充分裂解細胞后，4℃，12000rpm/min離心20min，將上清吸到另一個Eppendorf管中，Lowry法蛋白定量。加入3×上樣buffer混合，煮沸5分鐘，冷卻后取50μg蛋白進行SDS-PAGE電泳。然后通過半干式轉印到硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉，按預染標記的分子量剪裁轉印膜，分別加入兔抗人APOBEC3

11、G(1：200)、GAPDH(1：2000)一抗，37℃孵育1h，4℃過夜，洗膜，加入HRP標記的羊抗兔二抗，37℃30min，ECL發(fā)光顯色，圖像采集及分析處理。
　　 7.套氏聚合酶鏈反應(Nest-PCR)擴增HIV-1前病毒Vif全長及序列分析
　　 (1)套氏聚合酶鏈反應(Nest-PCR)擴增HIV-1前病毒Vif基因
　　 取每例感染者全血1ml，應用QIAamp Blood kit(Qiagen)

12、提取前病毒基因組DNA。取5μlDNA進行Nest-PCR擴增。外側引物序列為Po15：GAAGCCATGCATGGACAGGT，Vif2：AGGCTGACTTCCTGGATG。內側引物序列為Vif3：CATAAAAGTAGTGCCAAGAAGAAAAG，Vif4：TCTTAAGCTCCTCTAAAAGCTC。取PCR產物于1％瓊脂糖凝膠電泳，經與marker比對，確認所需片段，用QIAquik Gel Extraction Kit試劑

13、盒純化基因片段。將純化后的PCR產物，以Vif3、Vif4為測序引物，使用美國Applied Biosystem公司的BigDye TerminatorSequencing試劑盒和ABI377型DNA測序儀進行測序。
　　 (2)Vif核苷酸和氨基酸序列特征分析
　　 下載HIV序列庫(http://www.hiv.lanl.gov)中各亞型國際、國內HIV-1Vif序列，用BIOEDIT軟件包中CLASTAL W程序對

14、下載序列及測得序列進行排列比對。以phylogeny工具鄰位相連法(Neighbor-Joining)生成系統(tǒng)進化樹。使用Translation程序將核苷酸序列翻譯成蛋白質的氨基酸序列并與標準序列進行比對，分析各氨基酸位點的變化。
　　 8.體外SF33感染PBMC和IFN-α刺激實驗
　　 Ficoll密度梯度離心法分離健康人和HIV感染者PBMC，常規(guī)培養(yǎng)于含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中(37℃，5％CO

15、2)。實驗組細胞分別感染500TCID50的SF33和/或加入終濃度為100U/ml、400U/ml、800U/ml的IFN-α，于培養(yǎng)不同時間點收集培養(yǎng)上清于-20℃凍存，用于p24檢測；同時收集孔內細胞于15ml離心管，1000rpm/min離心10分鐘，PBS洗滌2次，棄盡上清，分別提取細胞總RNA和蛋白，用于APOBEC3G的mRNA和蛋白檢測。
　　 9.培養(yǎng)上清p24檢測
　　 采用Biomerieux公司p

16、24ELISA檢測試劑盒，嚴格按照說明書操作。
　　 10、統(tǒng)計學處理
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。計量資料結果以均值±標準差表示，病毒載量經log10對數(shù)轉換后用于統(tǒng)計學分析。研究對象不同分組APOBEC3G表達差異采用單因素方差分析，并進行均數(shù)兩兩比較；表達水平與CD4+T細胞數(shù)量、病毒載量的相關性采用Pearson相關分析。組間氨基酸取代頻率的差異比較采用Fisher's精確概率檢驗。氨基酸

17、位點有無取代兩組間CD4+T細胞數(shù)和病毒載量的組間比較采用均數(shù)t檢驗。
　　 結論:
　　 1.中國HIV/AIDS患者外周血單個核細胞APOBEC3G表達水平與疾病進展密切相關；高水平的APOBEC3G對感染HIV后疾病緩慢進展具有保護作用。
　　 2.中國HIV/AIDS患者HIV-1Vif與APOBEC3G作用的重要氨基酸位點相對保守。Vif序列中V7A取代與低病毒載量、高CD4+T細胞數(shù)有關；F39V取代