1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的感染呈全球性分布，我國也屬于HCV感染流行區(qū)。HCV是慢性肝炎、肝炎后肝硬化的主要病因之一，并與原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生關(guān)系十分密切。HCV非結(jié)構(gòu)蛋白5A(NS5A)是HCVRNA復(fù)制的重要組成部分。HCVNS5A能通過多種途徑激活細胞內(nèi)多種與細胞增殖有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如NF-KB、STAT-3PCNA等并能抑制由TNF-a及p53誘導(dǎo)的細胞凋亡。Survivin是近年來發(fā)現(xiàn)的一種凋亡

2、抑制蛋白，是凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis IAP)中的新成員，也是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子，在人類幾乎所有惡性腫瘤中均有明顯的表達。 本研究利用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染HCV NS5A表達質(zhì)粒(p<'CNS5A>)，用免疫細胞化學(xué)染色方法檢測轉(zhuǎn)染HCV NS5A是否成功，再通過RT-PCR和Western-blotting檢測方法探討HCV NS5A對Survivin基因表達的影響，了解HCV

3、NS5A促進細胞增殖和抑制細胞凋亡雙重生物學(xué)效應(yīng)的分子機制，探討HCV致原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)病機理。 方法： 1.HOV NS5A表達質(zhì)粒鑒定：采用雙酶切方法將p<'CNS5A>質(zhì)粒進行酶切，產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳。 2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前，在50ml培養(yǎng)瓶上種植5x10<'5>HepG2細胞，按美國生命技術(shù)公司提供脂質(zhì)體Lipofectin2000轉(zhuǎn)染程序，將p<'CNS5A>、p<'DNM>或p<'Rc/C

4、MV>質(zhì)粒導(dǎo)入細胞，24小時后換為10％胎牛血清培養(yǎng)基，72小時后收獲。 3.免疫細胞化學(xué)染色:免疫細胞化學(xué)法(ABC法)檢測HCVNS5A蛋白的表達，按說明書介紹的方法進行。 4.RT-PCR：按RNA提取劑Trizol試劑說明書，分別提取上述轉(zhuǎn)染細胞的總RNA，用DNase消化其中DNA雜質(zhì)。取4ugRNA，用MMLV逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進行PCR擴增，1％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。 5.Western-blott

5、ing：取上述各種處理細胞lxl0<'6>個，冰凍PBS洗3次，加裂解液，收集全蛋白上清。取50ug全蛋白在不連續(xù)SDS-PAGE膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至纖維膜，免疫染色。 結(jié)果： 1．p<'CNS5A>質(zhì)粒經(jīng)酶切后，可得到預(yù)期大小的HCVNS5A酶切片段。 2．轉(zhuǎn)染p<'CNSSA>質(zhì)粒組細胞內(nèi)有HCV NS5A蛋白表達，呈現(xiàn)棕黃色顆粒，分布在細胞漿中，以胞核周圍最明顯。未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染p<'Rc／CMV>空質(zhì)粒載體

6、組細胞內(nèi)則無HCVNS5A蛋白表達。 3．利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將分別轉(zhuǎn)染HCV NS5A質(zhì)粒和空質(zhì)粒的肝癌細胞株HepG2，用RT-PCR檢測Survivin mRNA的表達。實驗組Survivin mRNA表達明顯高于空白載體組和空白對照組(P<0.05)，而空白載體組和空白對照組Survivin mRNA表達相似(P>0.05)，說明空質(zhì)粒對Survivin mRNA表達無影響，主要是HCVNS5A激活SurvivinmRNA

7、表達。 4．利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別將p<'CNS5A>質(zhì)粒、p<'Rc／CMV>空質(zhì)粒、p<'CNS5A>質(zhì)粒+p<'DNM>質(zhì)粒、p<'SNM>質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至肝癌肝細胞株HepG2，用RT-PCR檢測各轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HepG2中Survivin mRNA的表達。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染p<'cNS5A>質(zhì)粒組條帶明顯高于轉(zhuǎn)染p<'Re/CMV>空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染p<'CNS5A>+p<'DNM>質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染p<'DNM>質(zhì)粒組(P<0.05)，

8、說明HCVNS5A可能是通過NF—кB調(diào)節(jié)Survivin mRNA表達。 5．利用Western blotting檢測兩種瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HepG2和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HepG2中Survivin蛋白的表達。實驗組Survivin蛋白表達明顯高于空白載體組和空白對照組，說明HCVNS5A促進Survivin蛋白表達。 結(jié)論： 1．HCV NS5A表達質(zhì)粒能成功轉(zhuǎn)染至肝癌肝細胞株HepG2中，表達HCV NS5A蛋白。