1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的持續(xù)感染是肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)發(fā)生的最主要因素。HBV X(HBx)基因在肝細胞基因組中的整合和X蛋白的反式激活作用對HCC的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義,但其致癌的分子機制目前尚不十分清楚。對HBx的研究大多著眼于X蛋白的反式激活功能,而忽略了HBx基因在肝細胞基因組整合的作用。研究表明,在HBV導致肝癌發(fā)生過程中,病毒DNA在宿主基因

2、組中有高頻率的整合,整合部位隨機分布于多條染色體上,這種整合多發(fā)生在HBV X基因區(qū)域。前期研究發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定整合HBx基因的人正常肝胞系(L-O2-X)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,推測HBx基因的整合可能與肝癌發(fā)生有直接關系。此外,HBx蛋白對HCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移具有重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),骨橋蛋白(osteopontin,OPN)及鈣蛋白酶小亞基1(calpain smallsubunit1,Capn4)與腫瘤細胞的生長、增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關。因

3、此,HBx蛋白可能通過OPN及Capn4促進肝癌細胞遷移。為了進一步闡明HBx基因/蛋白與肝癌發(fā)生發(fā)展的關系,本研究應用細胞模型和病人肝癌組織標本,探討了HBx基因整合在肝癌發(fā)生中的直接作用和HBx蛋白促進肝癌細胞遷移作用的分子機制,主要研究內(nèi)容如下:
　　 第一部分:HBx基因整合與肝癌發(fā)生關系的研究
　　 一、HBx基因突變體穩(wěn)定整合細胞模型的建立
　　 前期研究發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定整合HBx基因的人正常肝胞系(L-O

4、2-X)發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化,因此推測HBx基因的整合可能與肝癌發(fā)生有直接關系。但是,其中包含了HBx蛋白的反式激活作用。為了探討HBx基因整合與肝細胞轉(zhuǎn)化的直接關系,首先建立了無反式激活功能的HBx基因突變體穩(wěn)定整合的細胞模型。本研究中,HBx基因被隨機分成五個片段,并分別克隆到真核表達載體pCMVTag-2B,獲得的質(zhì)粒分別命名為pCMV-X1、pCMV-X2、pCMV-X3、pCMV-X4和CMV-X5。將此五個質(zhì)粒及克隆有全長HBx基

5、因的質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染人肝細胞L-O2使其蛋白過表達,同時檢測對核因子-κB(NF-κB)和人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子活性的影響,發(fā)現(xiàn)與野生型相比,五個突變的HBx基因片段失去了對NF-κB和hTERT啟動子活性的上調(diào)作用。通過基因轉(zhuǎn)染技術將克隆有這五個片段的質(zhì)粒分別導入人正常肝細胞系L-O2和人肝癌細胞系H7402中,經(jīng)G418篩選,獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系,分別命名為L-O2-X1、L-O2-X2、L-O2-X3、L-O2-X4

6、和L-O2-X5(或H7402-X1、H7402-X2、H7402-X3、H7402-X4和H7402-X5)。
　　 二、HBx基因片段整合導致肝細胞惡性轉(zhuǎn)化的作用
　　 為了闡明L-O2-X1、L-O2-X2、L-O2-X3、L-O2-X4和L-O2-X5細胞系的惡性表型,進行了免疫印跡實驗。結果顯示,與對照組相比,在L-O2-X3和L-O2-X5細胞中有甲胎蛋白(AFP)表達,而L-O2-X1、L-O2-X2和L-

7、O2-X4則檢測不到AFP。軟瓊脂克隆形成實驗顯示,與對照組相比,L-O2-X3和L-O2-X5細胞克隆形成能力顯著增強,而L-O2-X1、L-O2-X2和L-O2-X4細胞克隆形成能力與對照組相比無明顯差異。進一步研究發(fā)現(xiàn),將L-O2-X1、L-O2-X2、L-O2-X3、L-O2-X4和L-O2-X5分別皮下接種裸鼠后,L-O2-X3和L-O2-X5細胞接種的裸鼠在接種部位形成原位瘤,而L-O2-X1、L-O2-X2和L-O2-X4

8、細胞接種的裸鼠則未能成瘤。本結果說明,整合有HBx基因片段的L-O2-X3和L-O2-X5細胞發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)化,HBx基因整合與肝細胞的轉(zhuǎn)化直接相關。
　　 三、HBx基因整合導致肝細胞轉(zhuǎn)化分子機制的研究
　　 1、HBx基因整合模式的鑒定。提取L-O2-X細胞基因組DNA,應用HBx-AluPCR方法檢測HBx基因整合模式,測序結果顯示,HBx基因整合到Alu核心序列和亞端粒DNA(subtelomeric DNA)序列

9、上游,整合后HBx基因發(fā)生了3’末端(381-465 bp)缺失,產(chǎn)生HBx基因/Alu核心序列/亞端粒DNA重組體。然后,設計針對該重組體中HBx基因和亞端粒的引物進行PCR,在其他HBx基因穩(wěn)定整合的細胞系(如H7402-X、3T3-X、HepG2-X和HepG2.2.15)中檢測上述重組體是否存在。結果顯示,僅在H7402-X細胞系中檢測到該重組體。
　　 2、HBx基因/Alu核心序列/亞端粒DNA重組體與肝細胞轉(zhuǎn)化的關

10、系。為了闡明該重組體是否參與肝細胞的轉(zhuǎn)化,應用上述特異于HBx基因和亞端粒的引物,在穩(wěn)定整合HBx基因突變體的細胞系(L-O2-X1、L-O2-X2、L-O2-X3、L-O2-X4和L-O2-X5；H7402-X1、H7402-X2、H7402-X3、H7402-X4和H7402-X5)中進行驗證。結果顯示,在上述發(fā)現(xiàn)的已發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的L-O2-X3和L-O2-X5(或H7402-X3和H7402-X5)細胞中檢測到HBx基因/Alu核

11、心序列/亞端粒DNA重組體,而未發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞無該重組體。為了進一步提供HBx基因/Alu核心序N/亞端粒DNA重組導致肝細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的證據(jù),應用報告基因及免疫印跡的方法對L-O2-X1、L-O2-X2、L-O2-X3、L-O2-X4、L-O2-X5和L-O2-X(或H7402-X1、H7402-X2、H7402-X3、H7402-X4、H7402-X5和H7402-X)細胞系轉(zhuǎn)錄因子啟動子活性及癌蛋白表達進行檢測,結果顯示NF-κB、

12、AP-1和hTERT啟動子活性在L-O2-X3、L-O2-X5和L-O2-X、(或H7402-X3、H7402-X5和H7402-X)細胞中顯著增強,而在L-O2-X1、L-O2-X2和L-O2-X4則與對照組無明顯差異。c-Myc、PCNA和Bcl-2蛋白表達在L-O2-X3、L-O2-X5和L-O2-X、(或H7402-X3、H7402-X5和H7402-X)細胞中顯著上調(diào),而在L-O2-X1、L-O2-X2和L-O2-X4細胞中則

13、與對照組無明顯差異。提示,HBx基因整合導致的HBx基因/Alu核心序列/亞端粒DNA重組是肝細胞轉(zhuǎn)化的重要因為之一。
　　 3、在肝癌和癌旁組織中檢測HBx基因/Alu核心序列/亞端粒DNA重組體。應用PCR方法對60例肝癌組織和癌旁組織中HBx基因進行檢測,發(fā)現(xiàn)HBx在60例肝癌組織及其癌旁組織中有44例(73.3％)。然后,應用PCR方法在44例HBx陽性的肝癌組織及其癌旁組織中檢測上述重組體,結果發(fā)現(xiàn)其中有5例肝癌組織中

14、存在與細胞模型中相同的HBx基因/Alu核心序列/亞端粒DNA重組體,而在其對應的癌旁組織無上述重組體,臨床標本檢測結果進一步證實HBx基因/Alu核心序列/亞端粒DNA重組與肝癌發(fā)生有密切的關系。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)HBx基因整合與肝細胞轉(zhuǎn)化具有直接的關系,HBx基因/Alu核心序列/亞端粒DNA重組導致基因組不穩(wěn)定是肝細胞轉(zhuǎn)化的重要因為之一。這一發(fā)現(xiàn)首次為揭示HBV DNA在肝細胞基因組中整合的致癌作用提供了直接證據(jù),對于肝癌

15、的預防具有重要的指導作用。
　　 第二部分:HBx蛋白促進肝癌細胞遷移分子機制的研究
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)OPN和Capn4與腫瘤細胞的生長、增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關。因此,HBx蛋白可能通過OPN及Capn4促進肝癌細胞遷移,為此進行了以下研究:
　　 一、HBx蛋白促進肝癌細胞遷移信號傳導途徑的研究
　　 本研究對HBx蛋白促進肝癌細胞遷移的信號傳導途徑進行了探討。前期研究發(fā)現(xiàn)HBx蛋白通過NF-κB上

16、調(diào)肝癌細胞HepG2和H7402中Capn4的表達；在此基礎上,進一步研究顯示HBx蛋白在啟動子轉(zhuǎn)錄活性、mRNA及蛋白等水平通過5-脂氧化酶(5-LOX)上調(diào)肝癌細胞HepG2和H7402中OPN的表達；進而,OPN可以通過NF-κB上調(diào)肝癌細胞HepG2和H7402中Capn4的表達；而Capn4則以正反饋的形式對肝癌細胞HepG2和H7402中OPN的表達起調(diào)節(jié)作用。體外劃痕實驗顯示,HBx蛋白可顯著增強肝癌細胞HepG2的遷移能

17、力,而對HepG2-X細胞中OPN或Capn4進行RNA干擾后,其遷移能力受到明顯抑制。表明,HBx蛋白通過正反饋環(huán)HBx/5-LOX/OPN/NF-κB/Capn4/OPN促進肝癌細胞遷移。
　　 二、HBx蛋白突變體HBxΔ127促進肝癌細胞遷移分子機制的研究
　　 實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)了一個新的HBx蛋白突變體,將其命名為HBx△127。研究表明,HBxΔ127具有明顯促進肝癌細胞增殖的作用。在此基礎上,本研究探討了