1、目的：觀察RNA干擾技術(shù)在抑制乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制與表達(dá)方面的作用，同時(shí)，對(duì)Dicer基因在RNA干擾產(chǎn)生機(jī)制中的作用進(jìn)行探討。 方法：(1)將13倍HBV基因克隆入pCDNA3．1中，構(gòu)建HBV真核表達(dá)載體pHBV，將其轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，建立HBV瞬時(shí)表達(dá)模型，并通過(guò)ELISA、免疫熒光、Southern和Northernblot檢測(cè)對(duì)該模型進(jìn)行評(píng)價(jià)；(2)針對(duì)乙型肝炎病毒的四個(gè)開(kāi)發(fā)放性讀碼框，設(shè)計(jì)并構(gòu)建十種shR

2、NA表達(dá)載體pShRNA；將pHBV和pShRNA共轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞，通過(guò)ELISA、免疫熒光、Southern、Northern、Westernblot和RT-PCR檢測(cè)，觀察HBV復(fù)制與表達(dá)受抑制的情況。(3)設(shè)計(jì)并構(gòu)建兩種針對(duì)Dicer基因中RNA酶III結(jié)構(gòu)域的shRNA表達(dá)載體，即pShRNA-D1和pShRNA-D2，先將其轉(zhuǎn)染HepG22．2．15細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，觀察Dicer基因受抑的情況。將pSh

3、RNA-Dl轉(zhuǎn)染整合了綠色熒光蛋白(GFP)基因的HepG2A9細(xì)胞，以抑制其Dicer基因的表達(dá)，再轉(zhuǎn)染抗GFP的shRNA表達(dá)載體，觀察Dicer受抑制后，是否影響后續(xù)shRNA表達(dá)載體的功能發(fā)揮，以此反映Dicer酶在RNA干擾產(chǎn)生機(jī)制中的作用。 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建了HBV真核表達(dá)載體pHBV，通過(guò)ELISA、免疫熒光、Southem和Northemblot能檢測(cè)到HBV的復(fù)制與表達(dá)，說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)染pHBV可以建立HBV瞬

4、時(shí)感染模型。(2)成功構(gòu)建了十種針對(duì)HBV的shRNA表達(dá)載體，通過(guò)ELISA、免疫熒光、Southern、Northern、Westemblot及RT-PCR等，觀察到HBV復(fù)制與表達(dá)均受到明顯抑制，說(shuō)明RNA干擾可以有效抑制HBV的復(fù)制與表達(dá)。(3)成功構(gòu)建了兩種針對(duì)Dicer基因中RNA酶III結(jié)構(gòu)域的shRNA表達(dá)載體，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在三個(gè)細(xì)胞系中，Dicer基因的表達(dá)均受到明顯抑制，說(shuō)明通過(guò)載體表達(dá)shRNA的方式