1、乳酸菌是人和動物腸道中的重要生理菌群之一，具有維持腸道內菌群平衡，提高機體免疫力，促進營養(yǎng)物質吸收等多種功能。一些乳酸菌屬還能代謝產生有機酸、雙乙酰、過氧化氫、細菌素等物質，而這些物質能夠抑制病原菌和腐敗菌，是微生態(tài)制劑具有特殊保健功能的原因之一。除具有益生菌功能外，乳酸菌還可作為宿主菌表達抗原或外源蛋白，作為疫苗載體刺激粘膜免疫應答或作為功能性或治療性蛋白的傳遞載體。但目前，乳酸菌口服后在胃腸道中的活動狀況，其作為疫苗載體刺激免疫應答

2、的免疫機制等問題還不清楚。要弄清楚乳酸菌進入體內后的狀態(tài)，最好的方法就是對其進行標記然后跟蹤觀察。此外，無論是作為益生菌或是疫苗載體，乳酸菌到達腸道后均需要維持一定的活菌數(shù)才能發(fā)揮其作用，而口服需要經過胃酸環(huán)境，將對其存活率有極大影響，因此如何提高乳酸菌經胃酸環(huán)境后到達腸道的存活率是目前研究的一個熱點。 鑒于此，以乳酸菌中的典型菌屬——乳酸乳球菌為代表，制備其海藻酸鈣微囊，希望為其提供物理防護以抵抗胃腸道的惡劣環(huán)境。同時，我們在

3、乳酸乳球菌細胞內表達GFP，并以GFP表達為活菌標記，檢測乳酸乳球菌經口服后到達腸道的存活率，從而確定海藻酸鈣微囊包裹對乳酸乳球菌在胃腸道環(huán)境，特別是胃酸環(huán)境中的保護作用。 本文以乳酸乳球菌的NICE表達系統(tǒng)為基礎，選取該系統(tǒng)中的pNZ8150質粒為表達載體，將gfp基因插入其特定位置，構建GFP的重組表達載體。然后將該重組表達載體電轉化至宿主菌NZ9700和NZ9000中，構建GFP的組成型表達系統(tǒng)和誘導型表達系統(tǒng)。通過熒光顯

4、微鏡觀察以及熒光分光光度計測量熒光值，表明兩種系統(tǒng)均成功表達GFP。其中，組成型表達菌株的GFP表達量較大，約為誘導型表達菌株的8倍，而且傳代10次后仍能穩(wěn)定表達。 根據上述結果，選取穩(wěn)定表達GFP且表達量較大的組成型表達菌株（NZ9700:pNZ8150-gfp）作為囊心物，制備其海藻酸鈣微囊制劑。并通過體外耐酸實驗篩選最優(yōu)化微囊制備處方。將根據該優(yōu)化制備處方制備的NZ9700:pNZ8150-gfp海藻酸鈣微囊以及未包裹的N

5、Z9700:pNZ8150-gfp分別置于pH2.0酸性環(huán)境中進行體外耐酸實驗，一定時間后分別測量并比較兩者的存活率，從而確定該海藻酸鈣微囊對乳酸乳球菌在酸性環(huán)境中的保護作用。結果表明，酸處理30min，60min，90min，120min后，該海藻酸鈣微囊包裹分別使乳酸乳球菌的存活率提高了1370倍，525倍，235倍和105倍，說明其對乳酸乳球菌在酸性環(huán)境中有顯著的保護作用。 顯微鏡下觀察，根據該處方所制備的微囊樣品呈較規(guī)則

6、球狀。采用粒徑粒形分析儀測樣品粒徑，結果顯示，所制備微囊樣品粒徑范圍為3~80μm，平均粒徑為22.91μm。 然后將上述海藻酸鈣微囊包裹的NZ9700:pNZ8150-gfp灌胃至小鼠體內，以所表達的GFP為活菌標記，確定到達小腸內的活菌數(shù)，同時與未經包裹的NZ9700:pNZ8150-gfp灌胃小鼠組，以及空白小鼠組進行比較，確定海藻酸鈣微囊包裹對乳酸乳球菌在胃腸道環(huán)境中的保護作用。結果表明，以109CFU的活菌數(shù)灌胃，則灌

7、胃2h后，Microencapsulated Lactococcus lactis組小鼠小腸內的活菌數(shù)約為3.2×108CFU，而Free Lactococcus lactis組小鼠小腸內的活菌數(shù)約為3.4×106CFU，前者存活率約為后者的98倍，證明了海藻酸鈣包裹對乳酸乳球菌在胃腸道環(huán)境，特別是胃酸環(huán)境中確實有一定的保護作用。 通過以上研究，確定了對乳酸乳球菌在體外酸性環(huán)境中具有顯著的保護作用的海藻酸鈣微囊制備處方。根據該處