1、本研究組建立了APOBEC3G穩(wěn)定表達細胞株，觀察APOBEC3G抑制HBV復制過程中參與的信號通路及細胞因子；我們用熒光能量共振轉移(FRET)技術及表面離子共振實驗(SPR)檢查APOBEC3G與HBV核心抗原(HBc)之間是否有結合，并且觀察RNA對它們之間相互作用的關系的影響；同時我們構建APOBEC3G不同突變體，觀察它們對HBV復制的抑制作用并研究它們與HBc的關系。因此本研究共分為三個部分。
　　 第一部分：NF-

2、кB參與人APOBEC3G抗HBV過程之中
　　 研究目的：
　　 證實APOBEC3G能抑制HBV DNA復制和蛋白表達，建立穩(wěn)定過表達APOBEC3G的細胞株，觀察是NF-кB否參與APOBEC3G抗病毒過程中，探討APOBEC3G抗病毒機制。
　　 研究方法：
　　 轉染APOBEC3G到HepG2細胞以建立穩(wěn)定過表達APOBEC3G的細胞株，用PCR及western驗證細胞株是否構建成功，同時轉染

3、pcDNA3.1(-)-myc-his作為對照；用RT-CES系統(tǒng)實時檢測細胞的生長狀態(tài)；轉染pEGFPN-1到構建成功的細胞株中，用流式細胞儀及熒光顯微鏡檢測過表達APOBEC3G是否影響細胞接受外來質粒的能力；轉染1.3拷貝的HBV質粒，用熒光定量PCR檢測細胞中HBVDNA水平，用放射免疫法檢測上清中HBs Ag及Hbe Ag的表達量的變化；將pNF-кB-Luc質粒單獨或與1.3拷貝的HBV質粒共轉染到構建成功的細胞后，檢測熒光

4、素酶活性；轉染1.3拷貝的HBV質粒到構建成功的細胞后，用含有IKKβ抑制劑(IMD-0354)的培養(yǎng)基培養(yǎng)轉染，熒光定量PCR測HBVDNA水平的變化；設計引物，用相對熒光定量PCR檢測成功構建的細胞株中IL-6、IL-8、IL-1β、IL-lα的水平。
　　 研究結果：
　　 1.從RNA及蛋白水平證實穩(wěn)定表達APOBEC3G的HepG2細胞株構建成功；
　　 2.穩(wěn)定過表達的APOBEC3G能抑制HBV D

5、NA復制及HBs Ag及Hbe Ag的表達；
　　 3.APOBEC3G不影響HepG2細胞的生長，RT-CES系統(tǒng)實時檢測發(fā)現(xiàn)過表達APOBEC3G的HepG2細胞的生長狀態(tài)與對照沒有差異；
　　 4.APOBEC3G不影響HepG2細胞接受其他質粒，流式結果顯示過表達APOBEC3G的HepG2細胞的pEGFPN-1的轉染效率及熒光強度與對照組沒有差異；用熒光顯微鏡觀察得到同樣結果；
　　 5.APOBEC3

6、G能激活NF-кB，如果伴隨HBV的感染NF-кB更是被顯著激活；
　　 6.阻斷NF-кB的激活能抑制APOBEC3G抗病毒作用，用含有IKKβ抑制劑(IMD-0354)的培養(yǎng)基培養(yǎng)過表達APOBEC3G細胞時，APOBEC3G對HBVDNA的抑制效率只有42％，不加IMD-0354時APOBEC3G對HBV DNA的抑制達到90％；
　　 7.APOBEC3G能上調(diào)IL-6、IL-8及IL-1β在HepG2細胞中的表

7、達；但對IL-lα的表達沒有影響；
　　 研究結論：
　　 1.APOBEC3G能抑制HBV DNA復制及HBs Ag及Hbe Ag的表達；
　　 2.NF-кB參與APOBEC3G對HBV DNA的抑制過程中；
　　 3.APOBEC3G可能通過激活NF-кB再誘導IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子從而抗病毒。
　　 第二部分：APOBEC3G能直接結合HBV核心抗原
　　 研究目

8、的：
　　 觀察APOBEC3G與HBV核心抗原(HBc）之間的關系，了解它們是直接結合還是需要RNA或其他細胞成分的介導，探討APOBEC3G抗HBV病毒的作用機制。
　　 研究方法：
　　 構建pA3G-CFP及pHBc-YFP融合質粒，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察pA3G-CFP和pHBc-YFP在HepG2細胞中的定位；共轉染pA3G-CFP及pHBc-YFP到HepG2細胞中，用熒光共振能量轉移(FRET

9、)成像，再計算FR值，觀察細胞中APOBEC3G是否能結合HBc;構建帶有HA標簽pA3G-HA及HBc聚集缺陷突變體pHBc-Y132A-HA，表達并純化APOBEC3G及HBc-Y132A-HA蛋白，用BIAcore3000檢測純的APOBEC3G與HBc-Y132A-HA蛋白是否有相互作用，同時加入HepG2細胞RNA及HepG2.2.15細胞RNA看對它們的結合是否有影響。
　　 研究結果：
　　 1.成功構建p

10、A3G-CFP、pHBc-YFP、pA3G-HA及pHBc-Y132A-HA等質粒；
　　 2.用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到APOBEC3G散點狀分布在胞漿中，而HBc則在胞漿胞核中均有分布，兩個蛋白在胞漿中有共定位；
　　 3.三通道FRET在FRET通道檢測到APOBEC3G-CFP與HBc-YFP之間有FRET信號，F(xiàn)R值與陰性對照組相比有顯著差異；同樣熒光受體漂白實驗也檢測到APOBEC3G-CFP與HBc-YF

11、P之間有FRET信號；
　　 4.成功獲得APOBEC3G-HA及HBc-Y132A-HA蛋白，BIAcore3000檢測到APOBEC3G-HA與HBc-Y132A-HA之間有SPR信號；
　　 5.加入HepG2細胞RNA及HepG2.2.15細胞RNA后，APOBEC3G-HA與HBc-Y132A-HA之間的SPR信號沒有顯著改變。
　　 研究結論：
　　 1.APOBEC3G與HBc在HepG2細

12、胞中有相互作用；
　　 2.APOBEC3G能與HBc直接結合，而不依賴與細胞中的其他成分，細胞RNA及病毒RNA對他們的結合沒有影響。
　　 第三部分：APOBEC3G不同結構域對HBV的抑制作用及機制研究
　　 研究目標：
　　 研究APOBEC3G不同結構域對HBV DNA復制的影響，尋找APOBEC3G對HBV作用的功能域；尋找APOBEC3G與HBc的結合域。
　　 研究方法：
　

13、　 構建APOBEC3G功能域缺失體pCD1、pCD2和活性中心缺失體pDE12，將構建好的質粒分別與1.3拷貝HBV質粒共轉到HepG2細胞中，用熒光定量PCR檢測它們對HBV DNA的抑制效果；構建pCD1、pCD2、pDE12與CFP的融合質粒pCDl-CFP、pCD2-CFP、pDE12-CFP，將熒光蛋白融合質粒分別轉入HepG2細胞中，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察CD1、CD2和DE12在細胞中的分布；將pCDl-CFP、pC

14、D2-CFP，pDE12-CFP分別與pHBc-YFP共轉到HepG2細胞中，用熒光受體漂白實驗觀察它們與HBc的關系。
　　 研究結果：
　　 1.成功構建APOBEC3G功能域缺失體pCD1、pCD2及pDE12及pCDl-CFP、pCD2-CFP、pDE12-CFP;
　　 2.用激光掃描共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)CD1分布在胞漿中，而CD2在胞漿胞核中都有表達，DE12則分布在核周的胞漿中，且CD1和DE12有聚集

15、現(xiàn)象；
　　 3.CD1和CD2均能顯著抑制HBV DNA的復制，且CD2的抑制效果比全長APOBEC3G的抑制效果更顯著，兩個活性中心都去掉的DE12的抑制作用則相對較弱；
　　 4.熒光受體漂白實驗檢測到CDl-CFP、CD2-CFP與HBc-YFP之間都有FRET信號，但是CD2-CFP與HBc-YFP之間的信號比CDl-CFP與HBc-YFP之間的信號弱，且都比全長APOBEC3G與HBc之間的信號弱，DE12-

16、CFP與HBc-YFP之間沒有檢測到FRET信號。
　　 研究結論：
　　 1.APOBEC3G的兩個功能域都能抑制HBV的復制，這說明APOBEC3G的抑制機制不是單一的；
　　 2.APOBEC3G的兩個功能域都能與HBc結合，但是N端結構是主要結合域。
　　 全文結論
　　 1.APOBEC3G能顯著抑制HBV DNA的復制及蛋白表達，且NF-кB可能參與APOBEC3G抗HBV過程之中；<