丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4A、4B與肝細胞相互作用的機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)感染不僅引起急、慢性病毒性肝炎,而且與肝纖維化和肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展進程密切相關(guān)。病毒感染肝細胞后,病毒的核酸、蛋白與肝細胞的核酸、蛋白等生物大分子之間的相互作用是病毒致病的主要分子機制之一。HCV基因組長約9.6kb,含有一個長的開放閱讀框架(ORF),編碼一個約3010~3033個氨基酸殘基(aa)的多蛋白前體,經(jīng)宿主細胞信號肽酶和病毒蛋白酶加工成至少十種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白,C、

2、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。目前還發(fā)現(xiàn)核心蛋白C的編碼基因通過移框從而編碼一種新的17kD的F蛋白,這些蛋白在病毒的復(fù)制和繁殖中各有不同的功能,但某些具體機制尚不清楚。本研究以兩個非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A、NS4B為研究對象,旨在探討HCVNS4A和NS4B蛋白對肝細胞基因表達譜的調(diào)節(jié)及與肝細胞蛋白之間的相互作用,對于了解HCVNS4A、NS4B蛋白的致病機制及尋找有效防治HCV的方法具有重要意義

3、。 為研究NS4A、NS4B蛋白的反式激活功能,我們構(gòu)建了NS4A、NS4B的真核表達載體pcDNA3.1(-)-NS4A和pcDNA3.1(-)-NS4B,分別將其與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶報告基因表達質(zhì)粒pCAT3-Promoter(含有SV40早期啟動子)共轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系HepG2,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞中氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因的表達活性;以表達質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-NS4A和pcDNA3.1(-)

4、-NS4B轉(zhuǎn)染HepG2細胞,空載體pcDNA3.1(-)為平行對照,制備轉(zhuǎn)染后的細胞裂解液,應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)(suppressionsubtractivehybridization,SSH),構(gòu)建HCVNS4A、NS4B反式激活相關(guān)基因差異表達的cDNA消減文庫,對篩選的克隆進行測序及同源性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),NS4A、NS4B能夠反式激活SV40啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,進而促使其調(diào)控的下游CAT基因表達增強,NS4B的反式激活作用強于N

5、S4A。消減雜交分析顯示,NS4A、NS4B能夠上調(diào)肝細胞中多種基因的表達,包括與細胞生長調(diào)節(jié)、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)翻譯合成、腫瘤發(fā)生及物質(zhì)代謝密切相關(guān)的蛋白編碼基因;此外,我們還篩選到兩個新基因,分別命名為NS4A反式激活基因NS4ATP1和NS4ATP2,GenBank號分別為AY740521和AY846876。為篩選NS4A、NS4B的肝細胞結(jié)合蛋白,我們分別構(gòu)建了NS4A、NS4B的酵母表達載體pGBKT7-NS4A和pGBK

6、T7-NS4B,并轉(zhuǎn)化酵母細胞AH109,以SDS-PAGE和Westernblotting分析蛋白表達。以NS4A、NS4B為誘餌蛋白,應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù),在肝細胞文庫中釣取NS4A、NS4B的肝細胞結(jié)合蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NS4A、NS4B在AH109酵母細胞中成功表達出相對分子量為27kD和48kD的融合蛋白。雙雜交結(jié)果顯示,NS4A可與7種肝細胞蛋白相互作用,包括金屬硫蛋白、真核翻譯延伸因子1-α、血清白蛋白、RNA結(jié)合基序蛋白、肌漿

7、球蛋白結(jié)合蛋白、細胞色素C氧化酶Ⅱ及Na+K+ATP酶β1亞基。NS4B可與5種肝細胞蛋白相互作用,包括NADH脫氫酶亞單位3、細胞色素C氧化酶Ⅲ、視黃醇結(jié)合蛋白4、神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白及纖維蛋白原γ多肽。上述結(jié)果提供了HCVNS4A、NS4B蛋白在體內(nèi)可能存在的調(diào)控機制的線索。 我們進一步對兩個新基因功能進行了初步探討。將分子生物學(xué)技術(shù)與生物信息學(xué)技術(shù)相結(jié)合,首先從人肝癌細胞中成功克隆并鑒定了NS4ATP1和NS4ATP2基因

8、的全長編碼序列?;谠吮磉_系統(tǒng)具有操作簡單、成本低、表達蛋白量高等優(yōu)點,我們利用pET32a(+)原核表達載體和相應(yīng)的BL21(DE3)菌株,在體外成功表達了NS4ATP1和NS4ATP2蛋白。鑒于酵母中表達的蛋白質(zhì)能在酵母細胞中正確折疊與翻譯后修飾,我們又構(gòu)建了NS4ATP1和NS4ATP2的酵母表達載體,并在酵母細胞中成功表達了相應(yīng)的融合蛋白。上述結(jié)果為下一步兩種新蛋白具體的生物學(xué)功能、基因表達調(diào)控的深入研究提供了基礎(chǔ)。

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