慢病毒載體(miRNA Sponge)介導miR-17、miR-20a基因沉默的抗白血病作用機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:構建miR-20a基因的miRNA Sponge載體,建立Jurkat-S穩(wěn)定細胞株,為進一步研究miR-20a功能及應用干擾技術治療奠定基礎;檢測急性白血病患者中miR-17、miR-20a前體的表達情況并探討miRNA Sponge介導的miR-17、miR-20a沉默的抗白血病作用機制。
  方法:設計、合成一對含有2個重復針對miR-20a成熟序列第9-12堿基錯配的序列,并帶有酶切位點,退火后連接到pCDNA3.0

2、-L表達載體上;載體雙酶切后再與退火產物連接,重復4次,酶切及熒光素酶活性鑒定;亞克隆到慢病毒表達載體,與psPAX2、PMD2G共轉染HEK293T細胞,包裝產生慢病毒顆粒并測定病毒滴度,感染高表達miR-17、miR-20a的Jurkat細胞株;應用real-time PCR和Western blot技術分別檢測Jurkat-S穩(wěn)定細胞中P21及E2F1 mRNA和蛋白水平的表達,并與對照組進行比較;CCK-8方法及流式細胞儀方法分

3、別檢測miR-17、miR-20a沉默對Jurkat細胞增殖能力及細胞周期的影響。采用real-time PCR方法檢測初治急性白血病患者及白血病細胞株中miR-17、miR-20a前體的表達水平,分析其在各型白血病中的表達情況。
  結果:成功構建針對miR-20a基因的Sponge載體,病毒滴度為5×107TU/ml;建立穩(wěn)定轉染的Jurkat-S細胞株,有效干擾驗證顯示miR-20a Sponge能明顯上調P21及E2F1的

4、mRNA及蛋白水平,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05);初治急性白血病患者中miR-17、miR-20a前體的表達明顯高于正常對照(p<0.05);且與急性髓系白血病患者相比,急性淋巴細胞白血病患者中的表達量更高;然而二者表達量與患者外周血白細胞水平無明顯相關性(p>0.05);miR-17、miR-20a沉默能抑制Jurkat細胞的增殖,且導致細胞周期阻滯于G1-S期。
  結論:成功構建miR-20a基因的miRNA Spong

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