1、背景與目的
　　 當(dāng)前HIV感染在全球流行形勢嚴(yán)峻,抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療可以緩解病情,延長患者生存期,但費(fèi)用昂貴,藥物副反應(yīng)較多。
　　 中和性抗體是阻斷HIV暴露后對易感細(xì)胞感染的第一道防線,誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性抗體是HIV疫苗研究的主要目標(biāo),應(yīng)用中和性抗體被動免疫治療可有效抑制HIV在感染者體內(nèi)復(fù)制。具有廣泛交叉中和作用的HIV抗體非常少見,通過疫苗誘導(dǎo)其產(chǎn)生的希望仍然渺茫,這些廣泛交叉中和性抗體在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的來源有限

2、,難以大規(guī)模生產(chǎn)是限制其廣泛應(yīng)用的主要障礙。
　　 單克隆抗體4E10是從HIV感染者分離獲得,它對幾乎所有HIV分離株均有中和作用,是目前已知最高水平的HIV中和抗體。Ⅰ期臨床研究表明4E10單抗在人體應(yīng)用是安全的,可以有效抑制HIV病毒復(fù)制。具有開發(fā)作為被動免疫治療HIV感染及暴露后預(yù)防用藥的潛在價(jià)值。
　　 本研究擬采用果蠅S2細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)純化HIV高效中和抗體4E10,驗(yàn)證其對HIV的中和活性,探索利用基因工程技

3、術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)HIV中和抗體,為應(yīng)用中和抗體被動免疫防治HIV感染打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.將4E10抗體Fab段氨基酸序列(Protein Data Bank code number:1TZG)與人IgG1抗體Fc段氨基酸進(jìn)行拼接,得到完整IgG1型4E10抗體輕、重鏈氨基酸序列,利用Vector NTI軟件推導(dǎo)出輕、重鏈編碼基因序列并進(jìn)行果蠅細(xì)胞表達(dá)密碼子優(yōu)化。
　　 2.Overlap PCR分

4、別合成4E10輕、重鏈編碼基因,通過酶切位點(diǎn)BglⅡ和EcoRⅠ定向克隆至果蠅S2細(xì)胞表達(dá)載體pMT BiP/V5 His A。
　　 3.先利用盒式突變技術(shù)對測序克隆與預(yù)期設(shè)計(jì)不符的基因位點(diǎn)進(jìn)行突變改造,再通過質(zhì)粒點(diǎn)突變技術(shù)刪除目的基因5’端酶切位點(diǎn)BgⅡ,避免表達(dá)抗體N端多余氨基酸影響抗體效力。質(zhì)粒點(diǎn)突變過程在PCR buffer中加DMSO驗(yàn)證其增強(qiáng)Pyrobest酶擴(kuò)增高GC含量目的基因的能力以及DpnI是否可直接加入含

5、DMSO的PCR產(chǎn)物中酶切甲基化模板質(zhì)粒。
　　 4.4E10輕、重鏈基因表達(dá)載體與選擇載體pCoBlast共轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞,通過Blasticidin篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞,Western Blot鑒定培養(yǎng)上清IgG14E10表達(dá),限制性稀釋法挑選單克隆表達(dá)細(xì)胞。
　　 5.S2細(xì)胞旋轉(zhuǎn)搖瓶大量培養(yǎng),上清收集濃縮,HiTrap Protein G柱純化,采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測表達(dá)4E10抗體的HIV中和活性。
　

6、　 結(jié)果：
　　 1.利用overlap PCR技術(shù)成功合成了局部GC含量高達(dá)71.9％的4E10抗體輕、重鏈編碼基因并克隆至S2細(xì)胞表達(dá)載體。
　　 2.利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了翻譯后氨基酸序列與預(yù)期設(shè)計(jì)一致的IgG14E10抗體輕、重鏈基因表達(dá)克隆(pMT4E10 L及pMT4E10 H)。
　　 3.4E10表達(dá)載體與pCoBlast共轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞后,經(jīng)過Blasticidin篩選獲得了穩(wěn)定分泌表達(dá)Ig

7、G14E10的S2細(xì)胞,進(jìn)一步通過限制性稀釋法篩選出多個(gè)單克隆表達(dá)細(xì)胞。
　　 4.通過旋轉(zhuǎn)搖瓶大量培養(yǎng)和蛋白G柱純化,獲得4E10的產(chǎn)量為1.4mg/L。純化的4E10抗體能夠抑制復(fù)制型HIV Bm-Yu2感染靶細(xì)胞,隨著濃度提高,抑制作用增強(qiáng)。在500nM濃度時(shí),抑制效果達(dá)75％。
　　 結(jié)論：
　　 1.overlap PCR技術(shù)是獲得重組目的基因的有效方法。
　　 2.PCR buffer中加5％

8、DMSO能夠顯著增強(qiáng)Pyrobest酶擴(kuò)增高GC含量基因的能力,DpnI可以在含有DMSO的PCR buffer中發(fā)揮很好酶活性。
　　 3.通過4E10輕、重鏈表達(dá)載體與pCoBlast選擇載體共轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞及blasticidin篩選,能夠較快建立穩(wěn)定分泌表達(dá)IgG14E10抗體的細(xì)胞克隆。
　　 4.果蠅S2細(xì)胞表達(dá)的IgG14E10抗體具有抑制HIV感染的功能。
　　 5.可以利用果蠅S2細(xì)胞大規(guī)模表