1、背景與目的
　　 當前HIV感染在全球流行形勢嚴峻,抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療可以緩解病情,延長患者生存期,但費用昂貴,藥物副反應較多。
　　 中和性抗體是阻斷HIV暴露后對易感細胞感染的第一道防線,誘導產(chǎn)生中和性抗體是HIV疫苗研究的主要目標,應用中和性抗體被動免疫治療可有效抑制HIV在感染者體內(nèi)復制。具有廣泛交叉中和作用的HIV抗體非常少見,通過疫苗誘導其產(chǎn)生的希望仍然渺茫,這些廣泛交叉中和性抗體在哺乳動物細胞中表達的來源有限

2、,難以大規(guī)模生產(chǎn)是限制其廣泛應用的主要障礙。
　　 單克隆抗體4E10是從HIV感染者分離獲得,它對幾乎所有HIV分離株均有中和作用,是目前已知最高水平的HIV中和抗體。Ⅰ期臨床研究表明4E10單抗在人體應用是安全的,可以有效抑制HIV病毒復制。具有開發(fā)作為被動免疫治療HIV感染及暴露后預防用藥的潛在價值。
　　 本研究擬采用果蠅S2細胞系統(tǒng)表達純化HIV高效中和抗體4E10,驗證其對HIV的中和活性,探索利用基因工程技

3、術大規(guī)模生產(chǎn)HIV中和抗體,為應用中和抗體被動免疫防治HIV感染打下實驗基礎。
　　 方法：
　　 1.將4E10抗體Fab段氨基酸序列(Protein Data Bank code number:1TZG)與人IgG1抗體Fc段氨基酸進行拼接,得到完整IgG1型4E10抗體輕、重鏈氨基酸序列,利用Vector NTI軟件推導出輕、重鏈編碼基因序列并進行果蠅細胞表達密碼子優(yōu)化。
　　 2.Overlap PCR分

4、別合成4E10輕、重鏈編碼基因,通過酶切位點BglⅡ和EcoRⅠ定向克隆至果蠅S2細胞表達載體pMT BiP/V5 His A。
　　 3.先利用盒式突變技術對測序克隆與預期設計不符的基因位點進行突變改造,再通過質(zhì)粒點突變技術刪除目的基因5’端酶切位點BgⅡ,避免表達抗體N端多余氨基酸影響抗體效力。質(zhì)粒點突變過程在PCR buffer中加DMSO驗證其增強Pyrobest酶擴增高GC含量目的基因的能力以及DpnI是否可直接加入含

5、DMSO的PCR產(chǎn)物中酶切甲基化模板質(zhì)粒。
　　 4.4E10輕、重鏈基因表達載體與選擇載體pCoBlast共轉(zhuǎn)染S2細胞,通過Blasticidin篩選出穩(wěn)定表達細胞,Western Blot鑒定培養(yǎng)上清IgG14E10表達,限制性稀釋法挑選單克隆表達細胞。
　　 5.S2細胞旋轉(zhuǎn)搖瓶大量培養(yǎng),上清收集濃縮,HiTrap Protein G柱純化,采用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測表達4E10抗體的HIV中和活性。
　

6、　 結果：
　　 1.利用overlap PCR技術成功合成了局部GC含量高達71.9％的4E10抗體輕、重鏈編碼基因并克隆至S2細胞表達載體。
　　 2.利用基因定點突變技術獲得了翻譯后氨基酸序列與預期設計一致的IgG14E10抗體輕、重鏈基因表達克隆(pMT4E10 L及pMT4E10 H)。
　　 3.4E10表達載體與pCoBlast共轉(zhuǎn)染S2細胞后,經(jīng)過Blasticidin篩選獲得了穩(wěn)定分泌表達Ig

7、G14E10的S2細胞,進一步通過限制性稀釋法篩選出多個單克隆表達細胞。
　　 4.通過旋轉(zhuǎn)搖瓶大量培養(yǎng)和蛋白G柱純化,獲得4E10的產(chǎn)量為1.4mg/L。純化的4E10抗體能夠抑制復制型HIV Bm-Yu2感染靶細胞,隨著濃度提高,抑制作用增強。在500nM濃度時,抑制效果達75％。
　　 結論：
　　 1.overlap PCR技術是獲得重組目的基因的有效方法。
　　 2.PCR buffer中加5％

8、DMSO能夠顯著增強Pyrobest酶擴增高GC含量基因的能力,DpnI可以在含有DMSO的PCR buffer中發(fā)揮很好酶活性。
　　 3.通過4E10輕、重鏈表達載體與pCoBlast選擇載體共轉(zhuǎn)染果蠅S2細胞及blasticidin篩選,能夠較快建立穩(wěn)定分泌表達IgG14E10抗體的細胞克隆。
　　 4.果蠅S2細胞表達的IgG14E10抗體具有抑制HIV感染的功能。
　　 5.可以利用果蠅S2細胞大規(guī)模表