1、[背景和目的]
　　胰腺癌(Pancreatic carcinoma)是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來,在世界范圍內,其發(fā)病率呈現出明顯上升的趨勢。在歐美等工業(yè)發(fā)達國家,胰腺癌已是死亡率高居第4位的常見惡性腫瘤,而在我國由于人口老齡化、生活和飲食習慣的改變、環(huán)境污染等諸多原因,我國胰腺癌的發(fā)病率也呈現上升的趨勢。腫瘤的常規(guī)治療方式有手術、放射治療、化學治療。但由于該病發(fā)病部位隱蔽、早期無特異性體征、高度的侵襲性和進展性,大多

2、數患者在確診時已達局部晚期或發(fā)生遠處轉移,而且即使是早期發(fā)現、早期實施切除手術的原發(fā)腫瘤患者,相當一部分也會由于手術切除不徹底而發(fā)生局部復發(fā)或手術切除前已經出現了微轉移。2007年美國預期有37,170新發(fā)病患者,估計其死亡人數與發(fā)病人數相當(33,370),即絕大部分的患者在確診不到一年的時間內死去。目前,針對已經轉移的晚期患者的常規(guī)治療手段是化療,而作為全身治療方式的化學治療,無論從毒副作用、病人生活質量、生存期來看,效果都不盡如人

3、意?？紤]到該病發(fā)病的普遍性和高死亡率,因此,探索新的、有效的預防及治療方法顯得十分迫切。
　　無論是許多臨床前細胞、動物模型研究,還是臨床實驗研究,均已證實干擾素-γ(IFNγ)具有直接抑制腫瘤細胞的增殖、免疫調節(jié)和抑制腫瘤血管生成等諸多抗癌活性。但是由于靜脈注射重組IFNγ蛋白的體內半衰期短(僅幾分鐘),大劑量反復給藥系統(tǒng)毒性大,因此限制了其臨床應用。
　　腫瘤生物治療(Biotherapy)包括免疫治療和基因治療,是上世

4、紀80年代發(fā)展起來的建立在“改變宿主對腫瘤細胞的生物學反應而起到抗腫瘤的效果”。這種方法挾現代分子生物學和免疫學迅猛發(fā)展之勢,已被認為是繼腫瘤外科、放療、化療三大常規(guī)治療方式之后腫瘤綜合治療中的第四種模式,越來越受到重視。
　　本研究采用重組的腺病毒作為基因治療的載體,利用病毒感染腫瘤細胞使目的基因人干擾素γ基因導入腫瘤細胞,通過借助腫瘤細胞的蛋白合成系統(tǒng),將腫瘤細胞作為藥物合成的“工廠”持續(xù)合成分泌具有治療作用的IFNγ,可以避

5、免靜脈注射重組蛋白的半衰期短、反復給藥、毒副作用大等缺點,從而達到更好的治療效果。除了探討攜帶 IFNγ的腺病毒(Ad- IFNγ)在胰腺癌中的治療作用,還初步研究其可能的作用機制,并檢測其與近年來治療胰腺癌的一線藥物吉西他濱(gemcitabine)聯合用藥是否存在疊加或協同的治療效果。
　　[材料和方法]
　　利用HEK293細胞擴增攜帶IFNγ的腺病毒,通過氯化銫密度梯度純化病毒,以PCR鑒定純化的腺病毒,確定其含治療

6、基因、無野生型腺病毒(wt-Ad)、腺相關病毒(AAV)污染后,感染體外培養(yǎng)胰腺癌細胞株 Capan-2,體外不同時間檢測基因蛋白表達情況以及抗增殖效果、對細胞凋亡的影響;通過建立裸鼠皮下移植瘤模型,檢測瘤內注射抑瘤效果,并通過ELISA檢測荷瘤小鼠IFNγ組織動態(tài)分布情況、RT-PCR半定量檢測腫瘤組織中IFNγ基因表達、取腫瘤組織切片進行 HE染色、免疫組化檢測組織細胞增殖(Ki-67)、評價組織的凋亡(TUNEL)情況。
　

7、　[結果]
　　Ad- IFNγ感染細胞后能高效持續(xù)表達蛋白IFNγ,抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡。體內實驗表明:瘤內注射重組腺病毒可以抑制腫瘤生長;RT-PCR從轉錄水平、ELISA從蛋白水平證明治療基因產物IFNγ可以在腫瘤組織持續(xù)表達高達一周。酶聯免疫(ELISA)檢測顯示基因產物IFNγ主要分布在腫瘤組織中,其次是肝臟和血液中而其它臟器分布較少,在治療過程中小鼠未見明顯的系統(tǒng)毒副作用;Ad-IFNγ處理組小鼠的移植腫瘤與

8、對照組相比明顯小于對照組(PBS組和Ad-LacZ組),與Ad-LacZ組相比抑瘤率為42.56％±8.50%,而和PBS組相比抑瘤率為47.80%±8.96%。組織切片HE染色證明注射Ad- IFNγ的腫瘤組織壞死明顯;免疫組化檢測Ki-67,發(fā)現治療組腫瘤的Ki-67表達減少,而TUNEL檢測發(fā)現治療組與對照組相比凋亡明顯(P<0.05)。小鼠體內荷瘤實驗表明,注射Ad-IFNγ與低濃度的化療藥聯合應用可以增強抗腫瘤的效果,同時避免