1、第一部分、pLEGFP-N1-tPA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建、鑒定及包裝細(xì)胞PT67/pLEGFP-N1-tPA純系培育。 目的：構(gòu)建含人組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator，tPA）基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及產(chǎn)高滴度病毒的純包裝細(xì)胞系。 方法：用PCR方法擴(kuò)增目的基因tPA，定

2、向克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（pLEGFP-N1）中，酶切反應(yīng)、PCR及DNA測序鑒定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1-tPA；在基因轉(zhuǎn)染試劑SofastTM介導(dǎo)下將pLEGFP-N1-tPA轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞PT67，經(jīng)相應(yīng)的抗生素篩選、標(biāo)記、顯微移出，培育出全EGFP純包裝細(xì)胞系。用NIH3T3細(xì)胞測定病毒滴度。 結(jié)果：經(jīng)限制性酶切分析、DNA序列分析、EGFP的表達(dá)證實(shí)pLEGFP-N1-tPA中含有tPA基因。轉(zhuǎn)染有pLEGFP

3、-N1-tPA的純PT67細(xì)胞產(chǎn)病毒滴度為1×107CFU/ml。 結(jié)論：成功構(gòu)建了pLEGFP-N1-tPA載體和產(chǎn)高滴度病毒純包裝細(xì)胞系，為tPA 局部靶向治療的理想人工心瓣的研究和應(yīng)用奠定了實(shí)驗基礎(chǔ)。 第二部分、pLEGFP-N1-tPA感染ECUV304和心肌細(xì)胞，ECUV304/pLEGFP-N1-tPA建純系。 目的：觀察pLEGFP-N1-tPA感染ECUV304和心肌細(xì)胞后，ECUV304/pLE

4、GFP-N1-tPA純系上清和感染后心肌細(xì)胞上清在體外血栓模型中溶栓情況及tPA表達(dá)情況。 方法：pLEGFP-N1-tPA感染ECUV304細(xì)胞，單個強(qiáng)表達(dá)EGFP的ECUV304細(xì)胞→成簇→顯微移出→培育→成純系。建體外血漿平板血栓模型（用人全血），純系ECUV304/pLEGFP-N1-tPA培養(yǎng)上清加入模型中，設(shè)對照組，觀察溶解血栓情況，同時椐蚓激酶活性算出tPA活性。ELISA測出tPA含量。Western blot檢

5、測tPA。原代1-4d乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)，感染pLEGFP-N1-tPA，培養(yǎng)上清加入血漿平板血栓模型，設(shè)對照組，觀察溶解血栓情況，算出tPA活性，測出tPA含量。Westernblot檢測tPA。 結(jié)果：轉(zhuǎn)導(dǎo)有pLEGFP-N1-tPA的內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞上清在體外血栓模型中有大的溶解圈。ECUV304/pLEGFP-N1-tPA純系上清tPA活性是502.16u/106cells/24h，tPA含量是716.27ng/

6、106 cells/24h，Western blot檢出外源tPA條帶。心肌細(xì)胞/pLEGFP-N1-tPA上清tPA活性是464.27u/106 cells/24h，tPA含量是607.34ng/106 cells/24h，Western blot亦檢出外源tPA條帶。 結(jié)論：成功建立ECUV304/pLEGFP-N1-tPA純系，純系上清有明顯溶栓作用，tPA活性及含量均高，有外源tPA條帶。心肌細(xì)胞/pLEGFP-N1-t

7、PA上清有明顯溶栓作用，tPA活性及含量均高，有外源tPA條帶。 第三部分、在體研究特氟隆(Dacron) 片移植入兔下腔靜脈，Dacron片周圍局部轉(zhuǎn)導(dǎo)pLEGFP-N1-tPA。 目的：探討組織型纖溶酶原激活劑（tPA）基因局部轉(zhuǎn)導(dǎo)對特氟隆（Dacron）片（與機(jī)械瓣瓣環(huán)同質(zhì)）的溶血栓作用。 方法：70只兔建立下腔靜脈內(nèi)Dacron片植入血栓模型，隨機(jī)分為pLEGFP-N1-tPA治療組（n=30）、pLEG

8、FP-N1空載體對照組（n=20）、空白對照組（n=20），局部基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，于術(shù)后2d、75d各組一半動物取材（6個亞組A1、B1、C1、A2、B2、C2），聚光共聚焦（confocal）觀察所取靜脈增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）表達(dá)，體視鏡和電鏡觀察Dacron片表面血栓情況，免疫印跡（Western blot）、血漿平板和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分別檢測所取靜脈

9、tPA表達(dá)、溶栓、活性及含量變化。 結(jié)果：術(shù)后2d和75d取材，治療組所取靜脈，confocal均觀察到多而強(qiáng)的EGFP表達(dá)，pLEGFP-N1對照組也有EGFP表達(dá)，但空白對照組無EGFP表達(dá)。70個Dacron片加未植入組10個Dacron片共80個，在體視鏡（×160 倍）和電鏡（×500倍）下觀察，未植入組和治療組Dacron片表面均無血栓，對照組表面均有血栓。治療組所取靜脈Western blot檢測均有外源tPA表達(dá)

10、，對照組未檢測到。血漿平板顯示：治療組均有大的溶解圈，有明顯溶栓作用，對照組沒有；根據(jù)蚓激酶計算出的纖溶活性顯示：治療組術(shù)后2d和75d所取靜脈tPA活性分別為529.62±9.05u/g、537.50±12.45u/g，兩時間點(diǎn)比較，差異顯著性（P＞0.05）。術(shù)后2d和75d 治療組、兩對照組中6個亞組所取靜脈tPA含量分別為（A1 737.64±13.19）、（B1 29.88±5.61）、（C1 28.71±5.49）、(A2