1、登革病毒(Dengue virus，DEN)作為世界上最重要的人類蟲媒病毒之一已經威脅到熱帶和亞熱帶超過100個國家的25億人口。登革病毒一般情況下導致登革熱(dengue fever，DF)，但是部分病人可以進展為登革出血熱(denguehemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome，DSS)。DHF和DSS的發(fā)病機制尚未清楚，一般認為主要是由于病毒和宿主相互作用而介導。DHF

2、/DSS為重癥的登革病毒感染，其主要的特征之一是血漿滲漏。DF進展到DHF/DSS的過程尚未闡明，目前普遍認為DHF/DSS發(fā)病機制包括登革血清型間的交叉免疫反應、病毒的毒力以及感染后產生的抗體依賴增強(ADE)效應在DHF/DSS的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。一些免疫效應分子參與其病理機制。細胞因子水平尤其是腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)和一些化學介質的快速升高在DHF/DSS發(fā)病中起到了重要的作用，

3、引起一系列相應的臨床表現(xiàn)，如血漿外滲、休克、出血等。[2]而作為DHF/DSS發(fā)病中最重要的靶點——血管內皮細胞在登革病毒感染后又出現(xiàn)怎樣的變化呢?為了更好地揭示這個問題，本課題組用Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0芯片研究登革病毒感染血管內皮細胞后基因表達譜的變化。
　　 基因芯片技術是伴隨著人類基因組工程而興起的一門嶄新的技術，是一項專業(yè)基因分析技術，主要包括分析基因序列、檢測基因突變和

4、診斷疾病基因?；蛐酒夹g能夠檢測成千上萬基因的表達水平。通過分析這些數(shù)據(jù)，我們能夠全面了解登革病毒感染中各種基因表達的變化及其相應功能，為進一步研究這些基因與疾病之間的關系提供依據(jù)。[3]通過全面分析基因芯片結果，我們對登革病毒感染血管內皮細胞前后的基因表達變化有了全面和較為深刻的認識。
　　 目的：
　　 本研究旨在全面了解血管內皮細胞在登革病毒感染后基因水平的變化。
　　 內容和方法：
　　 1.原

5、代人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的分離、培養(yǎng)、鑒定：
　　 取新鮮臍帶分離、培養(yǎng)原代HUVEC。采用Ⅷ因子抗原免疫組織化學技術鑒定所分離的細胞。用生長穩(wěn)定，形態(tài)良好的第二至第四代細胞進行實驗。
　　 2.芯片實驗：
　　 通過總核糖核酸(RiboNucleic Acid，RNA)的提取和純化，互補脫氧核糖核酸(Complementa

6、ry Deoxyribonucleic acid，cDNA)的合成和純化，體外轉錄(In Vitro Transcription，IVT)合成互補核糖核酸(Complementary RiboNucleicacid，cRNA)和cRNA的純化，cRNA片段化、配制雜交液，芯片雜交，洗脫芯片，掃描芯片過程來完成芯片制作。
　　 3.基因芯片數(shù)據(jù)分析：
　　 采用專業(yè)芯片分析軟件和相關網站對結果進行分析。
　　 4.

7、實時定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)實驗：
　　 通過設計引物，提取RNA，逆轉錄反應，熒光定量PCR等步驟來完成實時定量PCR的實驗。
　　 結果：
　　 1.本研究共分離3個標本，每個標本均分為感染與未感染兩個組，共6張芯片。采用配對t檢驗分析感染組與未感染組間差異篩選出干擾素-α誘導蛋白6(interferon，alpha-inducible protein

8、6，IFI6)，干擾素誘導的跨膜蛋白1(interferoninduced transmembrane protein1，IFITM1)等共846個差異基因。目前有確定基因名稱的共有556個，其中上升的有299個基因，下降的基因有257個基因。
　　 2.經分析差異基因主要參與如下幾條通路：促性腺激素釋放激素信號通路，細胞外基質受體的相互作用，粘附途徑，ATP結合盒(ATP-binding cassette，ABC)運載體，長時

9、程增效作用，白細胞遷移作用，谷氨酸代謝，鈣信號通路，氮代謝通路。
　　 3.經分析差異基因的基因本體(Gene Ontology，GO)富集于以下幾個方面：免疫過程，免疫應答，配體依賴的核受體，終端紐，軸突組成部分，質膜組成部分，類固醇激素受體，體液平衡的調節(jié)。
　　 4.實時定量PCR結果顯示干擾素-α誘導蛋白27(interferon，alpha-inducible protein27，IFI27)，干擾素誘導蛋白4

10、4(interferon-induced protein44，IFI44)，IFITM1，干擾素誘導的17-KD蛋白(Interferon-induced17kDaprotein，ISG15)，IFI6這五個基因與芯片結果的趨勢一致，均顯示DEN感染組較未感染組表達升高。而在非差異基因的實時定量PCR結果中顯示：X連鎖凋亡抑制蛋白相關因子1(X-linked inhibitor ofapoptosis associated factor

11、1，XAF1)，信號轉導與轉錄激活因子1(signal transducers and activators oftranscriptionl，STAT)這兩個基因表現(xiàn)為感染組相對于未感染組呈上升趨勢，細胞分裂周期蛋白20(cell division cycle20homolog，CDC20)，基質金屬蛋白酶-14(matrix metallopeptidase14，MMP14)，小窩蛋白2(caveolin2，CAV2)這三個基因在實

12、時定量結果中表達量均無大的變化。趨化因子(C-X-C基序)受體4(chemokine(C-X-C motif)receptor4CXCR4)，干擾素誘導蛋白p78(myxovirus resistance1，MX1)，干擾素調節(jié)因子7(Interferon regulatory factor7，IRF7)表達量過低，超出檢測范圍。
　　 結論：
　　 1.登革病毒感染HUVEC后可引起多個基因表達發(fā)生改變，其中干擾素誘導