1、研究目的：
　　擬對MSI2基因在肝癌中與Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系作進一步的深入研究，以期為闡明肝癌的發(fā)生機制提供新的理論依據(jù)并為下一步可能的基因治療提供新的分子靶點。本文擬從以下三個方面進行研究:一:MSI2在HCC中的表達及臨床病理學意義研究;二:MSI2在體外實驗中對肝癌細胞惡性生物學行為的影響及機制研究;三:MSI2在體內(nèi)實驗中對肝癌進展的影響及調(diào)控機制研究。
　　研究方法：
　　一.MSI2在

2、HCC中的表達及臨床病理學意義研究
　　1.應(yīng)用RealtimePCR法在分子水平檢測10例肝癌患者MSI2及β-catenin基因的表達，并進一步分析MSI2及β-catenin的表達趨勢相關(guān)性。
　　2.應(yīng)用免疫組織化學方法檢測106例乙肝病毒相關(guān)性肝癌及癌旁硬化肝組織芯片中MSI2及β-catenin基因的表達，分析MSI2的表達變化與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性;分析MSI2與β-catenin的表達趨勢相關(guān)性;建立CO

3、X風險比例回歸模型，對肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的多種危險因素行回歸分析，并對肝癌患者總體生存及無瘤生存應(yīng)用Kplan-meier法行生存分析，探討MSI2的表達變化與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系。
　　二.MSI2在體外實驗中對肝癌細胞惡性生物學行為的影響及機制研究
　　1.應(yīng)用Realtime PCR法檢測三種肝癌細胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B中MSI2基因的表達，篩選高表達MSI2基因的細胞系。
　　2.構(gòu)建針對MS

4、I2基因的shRNA干擾表達載體，MTT法檢測不同shRNA干擾載體作用后的肝癌細胞增殖活性及細胞活力，篩選MSI2基因沉默最優(yōu)的shRNA干擾表達載體。
　　3.將攜帶RNAi表達載體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達MSI2基因的肝癌細胞系;應(yīng)用軟瓊脂克隆形成實驗檢測不用組別肝癌細胞的克隆形成能力;應(yīng)用劃痕修復(fù)實驗在不同時間點動態(tài)檢測不同組別肝癌細胞的遷移距離;Transwell法檢測不同組別肝癌細胞的穿膜細胞數(shù);應(yīng)用流式細胞儀檢測不同組別

5、肝癌細胞在不同細胞周期的凋亡分布以及對肝癌細胞周期變化的影響。
　　4.將攜帶RNAi表達載體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達MSI2基因的肝癌細胞系;Westernblot法及Realtime PCR法檢測不同組別Wnt/β-catenin信號通路上重要開關(guān)分子β-catenin、LEF-1、TCF-4的活性變化。
　　三.MSI2在體內(nèi)實驗中對肝癌進展的影響及調(diào)控機制研究
　　1.選擇4-6周齡的SPF級裸鼠為體內(nèi)實驗動物模型

6、，應(yīng)用分選的高表達MSI2基因的肝癌細胞系及轉(zhuǎn)染RNAi-MSI2的細胞系行細胞培養(yǎng)擴增后建立肝癌的皮下移植瘤模型，不同時間點動態(tài)觀察腫瘤大小、體積變化，繪制腫瘤生長曲線。
　　2.應(yīng)用上述建立的肝癌移植瘤模型，4周后切取腫瘤，拍照并測量腫瘤體積、重量，HE染色后對腫瘤內(nèi)肝癌細胞行病理分析;應(yīng)用Western blot及Realtime PCR法檢測肝癌移植瘤內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路上重要開關(guān)分子β-catenin、T

7、CF-4、LEF-1的活性變化。
　　結(jié)果：
　　一.MSI2在HCC中的表達及臨床病理學意義研究
　　1.MSI2表達上調(diào)與肝癌的進展及術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)
　　2.MSI2在肝癌的表達與β-catenin的表達具有相關(guān)性
　　3.MSI2表達上調(diào)可預(yù)測肝癌術(shù)后患者不良預(yù)后
　　二.MSI2在體外實驗中對肝癌細胞惡性生物學行為的影響及機制研究
　　1.MSI2在肝癌細胞系中高表達
　　2.M

8、SI2可增加肝癌細胞增殖活性
　　3.MSI2可促進肝癌細胞克隆形成
　　4.MSI2可提高肝癌細胞遷移、侵襲能力
　　5.MSI2可抑制肝癌細胞早期凋亡
　　6.MSI2可改變肝癌細胞周期分布、促進細胞增殖
　　7.MSI2可上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應(yīng)分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性
　　三.MSI2在體內(nèi)實驗中對肝癌進展的影響及調(diào)控機制研究
　　1

9、.MSI2在體內(nèi)促進腫瘤生長
　　為了進一步驗證MSI2對肝癌的作用及機制，我們采用SPF級4-6周齡裸鼠構(gòu)建肝癌皮下移植瘤模型，模擬人肝癌內(nèi)環(huán)境，以力求最客觀的驗證上述實驗結(jié)果;從繪制的腫瘤生長曲線中發(fā)現(xiàn)，MSI2 si-RNA組較Control組的腫瘤生長緩慢，但在最初10天內(nèi)觀察，兩組腫瘤體積無明顯差異，隨時間進展，兩組腫瘤體積出現(xiàn)顯著差異;切取瘤體后測量腫瘤體積及重量發(fā)現(xiàn)，MSI2 si-RNA組與Control組腫瘤體積

10、及重量差異顯著;這說明MSI2可在體內(nèi)促進腫瘤生長。
　　2.MSI2可增加肝癌細胞異型性
　　為了觀察MSI2 si-RNA組及Control組皮下移植瘤的細胞形態(tài)變化，我們將兩組切取的腫瘤行HE染色，觀察大體病理發(fā)現(xiàn)，MSI2 si-RNA組肝癌細胞體積較小，細胞分化程度相對高，瘤體內(nèi)可見少量間質(zhì)成分分布，細胞的異型性小，并可見組織壞死;Control組肝癌細胞數(shù)量多，體積豐滿，呈巢狀分布，無明顯間質(zhì)成分可見，細胞核體積

11、大、分化差，細胞異型性程度高;這從微觀上說明MSI2可增加肝癌細胞異型性、提高肝癌惡性行為傾向。
　　3.MSI2可在體內(nèi)上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應(yīng)分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性
　　為了驗證MSI2在體內(nèi)對肝癌生長、進展的調(diào)控機制，進一步闡明MSI2對Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應(yīng)分子β-catenin、LEF-1及TCF-4活性變化的影響，我們應(yīng)用wester

12、n blot技術(shù)在蛋白水平上檢測了MSI2 si-RNA組及Control組裸鼠皮下移植瘤中MSI2、β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSI2表達沉默后，Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應(yīng)分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的表達明顯下調(diào);我們進一步應(yīng)用realtime PCR法在轉(zhuǎn)錄水平檢測了MSI2 si-RNA組及Control組裸鼠皮下移植瘤中MSI2、β-catenin、L

13、EF-1及TCF-4的表達，結(jié)果顯示，MSI2表達沉默后，MSI2 si-RNA組β-catenin、LEF-1及TCF-4的表達較Control組明顯下調(diào);這在體內(nèi)實驗中進一步驗證了MSI2對Wnt/β-catenin信號通路下游重要效應(yīng)分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性影響;這說明MSI2可在體內(nèi)通過Wnt/β-catenin信號通路促進肝癌進展。
　　結(jié)論：
　　1.MSI2在乙肝病毒相關(guān)性肝癌中表達