1、第一章 人脂聯素基因的克隆和真核表達 目的：克隆人脂聯素基因(apMl)，構建真核表達載體pCDEF-apMl，檢測其在HEK293細胞中的表達水平，為脂聯素基因重組腺病毒的構建和表達提供實驗基礎；并構建球狀脂聯素(gAdiponectin)基因的真核表達載體，檢測其在人臍靜脈內皮細胞株HUVEC中的表達，為進一步研究脂聯素、球狀脂聯素的功能提供實驗基礎。 方法：應用RT-PCR法自人大網膜脂肪組織的總RNA中擴增出ap

2、MlcDNA全長基因，采用T-A克隆法重組到pGEM-TVectorSystem中，通過藍白斑篩選出陽性克隆后，測序鑒定。用PCR法從測序正確的pGEM-T-apMl質粒上，擴增出兩端帶有sfiI酶切位點的人脂聯素基因，再將擴增出的片斷亞克隆到T載體上，用sfiI酶切T載體和pCDEF空載體，將酶切后的片斷進行連接、轉化、篩選、鑒定、測序。將成功構建的pCDEF-apMl質粒轉染HEK293細胞，雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清中脂聯

3、素的表達水平。以構建好的質粒pGEMT-apMl為模板，PCR擴增出兩端帶有XhoI和HindIII酶切位點的人球狀脂聯素基因，將PCR產物和pcDEF／PPT-myc-His(一)A載體雙酶切后進行連接、轉化、篩選、測序。將成功構建的真核表達載體轉染HUVEC細胞，Westernblot檢測上清液中人球狀脂聯素蛋白的表達。 結果：從脂肪組織總RNA中擴增得到735bpapMl基因，其cDNA序列與GenBank報導的人脂聯素基

4、因apMl同源性為99.7％(159位和558位堿基發(fā)生了無義突變)，獲得了質粒pGEM-T-apMl，測序鑒定正確。構建的pCDEF-apMl質粒測序正確，能有效轉染HEK293細胞，并在培養(yǎng)上清中檢測到較高水平的脂聯素蛋白。構建的gAdiponectin基因的真核表達載體，經酶切、測序鑒定正確，并有效的轉染了HUVEC，經Westernblot在上清中檢測到了該基因的表達。 結論：成功的克隆了apMl基因全長cDNA。構建了

5、人脂聯素基因的真核表達載體pCDEF-apMl，并在HEK293細胞中獲得高效表達；成功的構建并鑒定了人球狀脂聯素基因真核表達載體，在HUVEC細胞中獲得了分泌表達，為人脂聯素基因重組腺病毒的構建和表達奠定了基礎。 第二章 人脂聯素基因重組腺病毒的構建、鑒定和表達 目的：構建含有人脂聯素基因apMl的重組腺病毒載體，制備能表達人脂聯素蛋白的重組腺病毒，為脂聯素用于體內外干預動脈粥樣硬化奠定基礎。 方法：自質粒pG

6、EM-T-apMl上擴增兩端帶有SalI和HindIII酶切位點的全長apMl基因，將PCR產物和穿梭質粒pShuttle-CMV經SalI和HindlII雙酶切后，連接、轉化、篩選，進行PCR鑒定后送雙向測序。將鑒定正確的重組質粒pShuttle-CMV-apMl用PmeI酶切使其線性化后與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1共轉BJ5183菌，進行細菌內同源重組，篩選、鑒定、擴增，PacI酶切后用LipofectamineTM2000轉

7、染低代數的HEK293包裝細胞，進行包裝出毒，并用HeLa細胞檢測重組腺病毒的生物安全性。重組腺病毒進行鑒定、擴增后，測定病毒滴度，感染HUVEC、HepG2細胞，確定最佳MOI，觀察對HUVEC、HepG2細胞生長的影響，并用ELISA檢測上清中人脂聯素蛋白的水平，Westernblot檢測細胞中人脂聯素蛋白的表達。 結果：重組穿梭質粒pShuttle-CMV-apMl經PCR和測序鑒定正確，與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1

8、同源重組成功，轉染293細胞進行包裝，產生的病毒經鑒定正確，并且無具有復制能力的腺病毒存在，生物安全性高，在HUVEC、HepG2細胞培養(yǎng)上清和細胞中檢測到apMl基因的蛋白表達。 結論：成功的制備了apMl基因重組腺病毒，并在HUVEC和HepG2細胞中獲得分泌表達，可進一步用于脂聯素干預動脈粥樣硬的研究。 第三章 人脂聯素基因重組腺病毒對HUVEC細胞的影響 目的：研究人脂聯素基因重組腺病毒對HUVEC細胞的

9、影響，觀察人脂聯素基因重組腺病毒保護血管內皮細胞和體外抗動脈粥樣硬化的作用。 方法：用人脂聯素基因重組腺病毒感染HUVEC細胞，雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清中人脂聯素、IL-10的表達水平，Westernblot檢測人脂聯素蛋白、MCP-1、ICAM-1、iNOS、eNOS蛋白表達，比色法檢測總NOS、iNOS、eNOS活力，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛水平，黃嘌呤氧化酶法測定SOD水平。 結果：用含報告基因LacZ的

10、對照腺病毒(Ad-LacZ)感染HUVEC細胞，檢測腺病毒的感染效率，確定最佳MOI為50，用MOI為50的人脂聯素基因重組腺病毒感染HUVEC細胞，24h、48h、72h后取上清檢測脂聯素濃度分別為140±9ng/ml、185±8ng/ml、170±10ng/ml。感染了Ad-apMl的HUVEC細胞上清總NO、IL-10水平顯著升高；總NOS和eNOS的活力和蛋白表達顯著升高，而iNOS的活力和蛋白表達顯著降低。感染了Ad-apMl

11、的HUVEC細胞SOD的活力顯著升高，而產生的丙二醛含量顯著降低。感染了Ad-apMl的HUVEC細胞MCP-1和ICAM-1蛋白表達顯著降低。 結論：我們制備的重組腺病毒能有效感染HUVEC細胞并分泌表達人脂聯素蛋白，可上調HUVEC細胞總NO、總NOS和eNOS的活力和蛋白表達，下調iNOS的活力和蛋白表達，具有抗氧化、保護血管內皮細胞的作用。而且還能使具有抗動脈粥樣硬化作用的細胞因子IL．10的表達水平顯著升高，下調黏附分