1、柑橘是我國(guó)南方重要的水果之一,其產(chǎn)業(yè)發(fā)展對(duì)促進(jìn)地區(qū)經(jīng)濟(jì)具有重要作用。近年來(lái)柑橘產(chǎn)業(yè)雖然取得了巨大的發(fā)展,但常受到干旱、鹽及低溫等各種非生物逆境脅迫,因此,如何高效培育柑橘抗逆新品種成為當(dāng)前育種學(xué)家亟需解決的課題。柑橘育種方法主要有常規(guī)育種、芽變選種和基因工程等,但常規(guī)育種存在雌雄性敗育,珠心胚干擾,遺傳高度雜合等問(wèn)題,而芽變選種培育周期過(guò)長(zhǎng),隨著生物技術(shù)水平的提高,特別是基因工程的發(fā)展,為柑橘的育種提供了一條新的途徑。抗逆機(jī)理解析及重要

2、基因克隆是基因工程的前題,是柑橘分子育種的關(guān)鍵。但目前柑橘抗性基因的克隆較少,鑒定出功能的基因更少,這嚴(yán)重阻礙了柑橘抗逆分子育種的步伐。從前人的研究得知,轉(zhuǎn)錄因子ABF、bHLH、ICE1及蛋白激酶MAPK在植物抗非生物脅迫中起重要作用,因此本研究從枳中分離、克隆得到ABF,MAPK、bHLH及ICE1基因,并對(duì)他們進(jìn)行抗逆功能鑒定。其目的是為了深入解析抗性基因的分子機(jī)理,獲得擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的柑橘抗性基因資源。主要研究結(jié)果如下： 1.

3、采用電子克隆從枳中克隆得到ABA響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子(PtrABF),它包含1347bp的開(kāi)放閱讀框,編碼448個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為48kD,等電點(diǎn)9.66。多序列比對(duì)顯示PtrABF與其它物種的ABF有很高的同源性。PtrABF定位于細(xì)胞核,有轉(zhuǎn)錄激活活性,能與ABRE元件結(jié)合,表明它是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。表達(dá)模式分析顯示它能被脫水、低溫及ABA誘導(dǎo)。煙草中超表達(dá)PtrABF,表明轉(zhuǎn)基因植株比未轉(zhuǎn)化植株的抗脫水和抗旱能力顯著提高。脫水和干

4、旱條件下轉(zhuǎn)基因植株比未轉(zhuǎn)化植株活性氧積累低,三種抗氧化酶的活性及基因表達(dá)量均較高。另外,在干旱處理前后,9個(gè)逆境相關(guān)基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因煙草中都比非轉(zhuǎn)基因植株高。所有結(jié)果顯示,PtrABF轉(zhuǎn)基因植株抗旱能力顯著提高。 2.利用電子克隆及RACE技術(shù)從枳中分離克隆出PtrMAPK,該基因包含1128bp開(kāi)放性閱讀框,編碼375個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為43kD,等電點(diǎn)為5.51。生物信息學(xué)分析表明PtrMAPK包括11個(gè)保守的激酶結(jié)構(gòu)域和一

5、個(gè)磷酸化位點(diǎn),亞細(xì)胞定位表明它定位于細(xì)胞核。PtrMAPK受干旱及低溫的誘導(dǎo)但不受鹽的誘導(dǎo)。與未轉(zhuǎn)化植株相比,PtrMAPK轉(zhuǎn)基因煙草超表達(dá)植株的抗脫水和抗旱能力明顯提高,進(jìn)一步研究表明,抗性增強(qiáng)與抗氧化酶活性提高相關(guān)。此外,轉(zhuǎn)基因煙草在干旱處理前后,相關(guān)逆境響應(yīng)基因的表達(dá)量明顯上升。研究結(jié)果表明,PtrMAPK轉(zhuǎn)基因植株具有較強(qiáng)的抗旱能力。 3.從枳中克隆出PtrbHLH基因,該基因全長(zhǎng)1921bp,它包括1464bp的開(kāi)放性閱讀框,

6、編碼487個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為5.30,分子量預(yù)測(cè)為53.6kD。多序列比對(duì)表明其編碼的氨基酸序列中含有保守的ZIP結(jié)構(gòu)域、bHLH結(jié)構(gòu)域、C末段區(qū)域及SUMO結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PtrbHLH定位于細(xì)胞核,具有轉(zhuǎn)錄激活活性。ExPASy網(wǎng)站中的Signal P軟件預(yù)測(cè)表明PtrbHLH氨基酸序列中具有一個(gè)核定位信號(hào)(NLS)及一個(gè)bHLH DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；SMART預(yù)測(cè)PtrbHLH氨基酸序列中含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。PtrbHLH受低溫、脫

7、水及鹽的誘導(dǎo)。超表達(dá)PtrbHLH的轉(zhuǎn)基因檸檬和煙草植株的抗寒能力提高,但其RNAi-PtrbHLH轉(zhuǎn)入枳使其抗性下降。采用Affymetrix芯片雜交分析表明,PtrbHLH的轉(zhuǎn)基因檸檬中有108個(gè)基因上調(diào),其中包括與H202清除有關(guān)的POD基因。進(jìn)一步研究表明,超表達(dá)PtrbHLH的轉(zhuǎn)基因植株(煙草和檸檬)中POD活性強(qiáng),在氧化脅迫下抗性也增強(qiáng)。但采用POD抑制劑處理轉(zhuǎn)基因煙草后,H202清除能力及抗寒性減弱。這些結(jié)果表明,Ptrb

8、HLH是通過(guò)調(diào)控POD來(lái)增強(qiáng)植物的抗寒能力。 4.采用電子克隆和RACE等手段從枳中克隆出PtrICE1基因,該基因包含一個(gè)1680bp的開(kāi)放閱讀框,編碼559個(gè)氨基酸,蛋白預(yù)測(cè)的分子量為61kD,等電點(diǎn)為5.27。生物信息學(xué)分析顯示PtrICE1氨基酸序列與其它植物氨基酸同源性較高,有兩個(gè)保守的bHLH結(jié)構(gòu)域和一個(gè)SUMO結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PtrICE1定位于細(xì)胞核,有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性以及能與順式作用元件MYC結(jié)合,這些都說(shuō)明它是一個(gè)轉(zhuǎn)錄