1、柑橘是我國南方重要的水果之一,其產業(yè)發(fā)展對促進地區(qū)經濟具有重要作用。近年來柑橘產業(yè)雖然取得了巨大的發(fā)展,但常受到干旱、鹽及低溫等各種非生物逆境脅迫,因此,如何高效培育柑橘抗逆新品種成為當前育種學家亟需解決的課題。柑橘育種方法主要有常規(guī)育種、芽變選種和基因工程等,但常規(guī)育種存在雌雄性敗育,珠心胚干擾,遺傳高度雜合等問題,而芽變選種培育周期過長,隨著生物技術水平的提高,特別是基因工程的發(fā)展,為柑橘的育種提供了一條新的途徑?？鼓鏅C理解析及重要

2、基因克隆是基因工程的前題,是柑橘分子育種的關鍵。但目前柑橘抗性基因的克隆較少,鑒定出功能的基因更少,這嚴重阻礙了柑橘抗逆分子育種的步伐。從前人的研究得知,轉錄因子ABF、bHLH、ICE1及蛋白激酶MAPK在植物抗非生物脅迫中起重要作用,因此本研究從枳中分離、克隆得到ABF,MAPK、bHLH及ICE1基因,并對他們進行抗逆功能鑒定。其目的是為了深入解析抗性基因的分子機理,獲得擁有自主知識產權的柑橘抗性基因資源。主要研究結果如下： 1.

3、采用電子克隆從枳中克隆得到ABA響應的轉錄因子(PtrABF),它包含1347bp的開放閱讀框,編碼448個氨基酸,預測蛋白質分子量為48kD,等電點9.66。多序列比對顯示PtrABF與其它物種的ABF有很高的同源性。PtrABF定位于細胞核,有轉錄激活活性,能與ABRE元件結合,表明它是一個轉錄因子。表達模式分析顯示它能被脫水、低溫及ABA誘導。煙草中超表達PtrABF,表明轉基因植株比未轉化植株的抗脫水和抗旱能力顯著提高。脫水和干

4、旱條件下轉基因植株比未轉化植株活性氧積累低,三種抗氧化酶的活性及基因表達量均較高。另外,在干旱處理前后,9個逆境相關基因的表達量在轉基因煙草中都比非轉基因植株高。所有結果顯示,PtrABF轉基因植株抗旱能力顯著提高。 2.利用電子克隆及RACE技術從枳中分離克隆出PtrMAPK,該基因包含1128bp開放性閱讀框,編碼375個氨基酸,蛋白質分子量為43kD,等電點為5.51。生物信息學分析表明PtrMAPK包括11個保守的激酶結構域和一

5、個磷酸化位點,亞細胞定位表明它定位于細胞核。PtrMAPK受干旱及低溫的誘導但不受鹽的誘導。與未轉化植株相比,PtrMAPK轉基因煙草超表達植株的抗脫水和抗旱能力明顯提高,進一步研究表明,抗性增強與抗氧化酶活性提高相關。此外,轉基因煙草在干旱處理前后,相關逆境響應基因的表達量明顯上升。研究結果表明,PtrMAPK轉基因植株具有較強的抗旱能力。 3.從枳中克隆出PtrbHLH基因,該基因全長1921bp,它包括1464bp的開放性閱讀框,

6、編碼487個氨基酸,等電點為5.30,分子量預測為53.6kD。多序列比對表明其編碼的氨基酸序列中含有保守的ZIP結構域、bHLH結構域、C末段區(qū)域及SUMO結合結構域。PtrbHLH定位于細胞核,具有轉錄激活活性。ExPASy網站中的Signal P軟件預測表明PtrbHLH氨基酸序列中具有一個核定位信號(NLS)及一個bHLH DNA結合結構域；SMART預測PtrbHLH氨基酸序列中含有一個轉錄激活結構域。PtrbHLH受低溫、脫

7、水及鹽的誘導。超表達PtrbHLH的轉基因檸檬和煙草植株的抗寒能力提高,但其RNAi-PtrbHLH轉入枳使其抗性下降。采用Affymetrix芯片雜交分析表明,PtrbHLH的轉基因檸檬中有108個基因上調,其中包括與H202清除有關的POD基因。進一步研究表明,超表達PtrbHLH的轉基因植株(煙草和檸檬)中POD活性強,在氧化脅迫下抗性也增強。但采用POD抑制劑處理轉基因煙草后,H202清除能力及抗寒性減弱。這些結果表明,Ptrb

8、HLH是通過調控POD來增強植物的抗寒能力。 4.采用電子克隆和RACE等手段從枳中克隆出PtrICE1基因,該基因包含一個1680bp的開放閱讀框,編碼559個氨基酸,蛋白預測的分子量為61kD,等電點為5.27。生物信息學分析顯示PtrICE1氨基酸序列與其它植物氨基酸同源性較高,有兩個保守的bHLH結構域和一個SUMO結合結構域。PtrICE1定位于細胞核,有很強的轉錄激活活性以及能與順式作用元件MYC結合,這些都說明它是一個轉錄