1、十五、生物技術藥物分析,1、概念：2、分類 ｛,生物技術藥物,重組DNA藥物重組蛋白質藥物,采用DNA重組技術或其他新生物技術生產(chǎn)的治療和預防藥物。,,1、重組蛋白質或重組多肽藥物包括： 細胞因子類：rIFN、IL-2、EPO等； 抗細胞素治療：CD4可溶性受體等； 重組溶血栓類：rSK、rSAK等； 人源化單克隆抗體制劑； 重組疫苗和菌苗制劑。,2、重組DNA藥物包括：寡核苷酸藥物：反義核酸等；

2、基因藥物：腺病毒-IL-2、腺相關病毒-凝血Ⅸ因子；腺病毒- P53細胞治療制劑：抗原致敏的人樹突狀細胞 DNA疫苗：治療乙型肝炎、愛滋病的核酸疫苗等。,生物技術藥物的質量控制與傳統(tǒng)生產(chǎn)方法所得產(chǎn)品有本質的差別?？赡軙杏脗鹘y(tǒng)生產(chǎn)方法不可能存在的有害雜質。例如在細菌中表達的產(chǎn)品可能有內毒素、致敏原，在動物細胞中表達的產(chǎn)品可能有DNA雜質和病毒。,重組產(chǎn)品質量控制上存在的難點,建立重組藥物的生物學活性測定方法；理化測定標準品的穩(wěn)定

3、性；人源化單抗中的人源化程度檢測方法及標準研究；重組人白蛋白等大劑量重組產(chǎn)品安全性評價問題；反義核酸藥物理化特性測定和效力測定，即如何評價反義核酸的體內及體外活力；基因治療藥物的安全性評價包括反轉錄病毒、生物分布和效力測定；DNA疫苗的安全性和效力檢測方法研究；干細胞治療產(chǎn)品的質量標準的建立（干細胞鑒定及活力測定） 。,生物技術藥物的質量控制,生物技術藥物的特點：1、來源：活的生物體（細菌或細胞）；2、結構：復雜（包括組

4、成、空間結構）；3、生產(chǎn)：涉及生物材料和生物學過程（發(fā) 酵、細胞培養(yǎng)，分離純化等）， 有其固有的易變性。,生物技術藥物的質量控制,質量控制包括兩個方面：1、生產(chǎn)過程中質量控制GMP（硬件、軟件）2、最終目標產(chǎn)品的質量控制（方法學研究）,質量控制方法學研究具體內容,一、結構鑒定和確證二、生物學活性測定和比活性三、蛋白質純度檢查四、蛋白質含量測定五、蛋白質藥物理

5、化性質的鑒定六、殘余雜質檢查,一、鑒定,采用適宜的技術鑒定生物技術原料藥或制劑的物理化學性質、生物活性、免疫化學性質、純度和雜質。,1、氨基酸序列,預期產(chǎn)品的氨基酸序列測定在很大程度上可應用如(b)~(e)款項中提到的測定方法，隨后與預期產(chǎn)品基因推導的氨基酸序列進行比較。,2、氨基酸組成,氨基酸組成是先用各種水解及微量氨基酸自動分析儀測定，然后再與產(chǎn)品基因推導的氨基酸組成進行對比。在大部分情況下，氨基酸組成分析對多肽和小分子蛋白質可

6、提供某些有用的結構資料，但對大分子蛋白很難確定。在大多數(shù)情況下，氨基酸定量分析也可用于確定蛋白質含量。,3、N末端和C末端氨基酸測序,末端氨基酸序列分析是用以鑒別多肽或蛋白質的氨基端和羧基端的性質及均一性。作為重組蛋白質和肽的重要鑒別指標，一般要求至少測定N-末端15個氨基酸、C-末端1～3氨基酸。如發(fā)現(xiàn)預期產(chǎn)品的氨基酸末端是異質的，應用適宜分析方法測定變異體的相對含量。,4、肽圖,用酶或化學物選擇性地將產(chǎn)品切成片段，切成的片段用

7、HPLC、SDS-PAGE電泳法、質譜法測定。驗證的方法測得的原料藥或制劑的肽圖，可作為批檢驗中確證預期產(chǎn)品結構的方法。,5、巰基和二硫鍵,二硫鍵和巰基與蛋白質的生物活性密切相關，發(fā)生錯誤配對，不但活性降低而且會引起抗原性增加。根據(jù)預期產(chǎn)品基因序列推導出半骯氨酸殘基，采用肽圖制備(還原和不還原情況下)、質譜或其他適宜的技術，測定游離SH基和/或二硫鍵的數(shù)目和位置。,評價用生物技術方法生產(chǎn)的糖蛋白時，應考慮糖基化位點的上調或下調及其對

8、生物活性、代謝、穩(wěn)定性、溶解性的影響。每一種真核細胞具有其獨特的糖基化能力稱為它的糖類型，通過基因工程方法將一種糖蛋白在不同細胞中表達，可以導致生產(chǎn)不同類型的糖蛋白，即使在相同的細胞類型中，也可能會出現(xiàn)糖形成時由于一些寡糖的精細結構不同等而產(chǎn)生截然不同的糖蛋白。,6、糖結構,對于糖蛋白，要測定糖含量(中性糖、氨基糖、唾液酸)。另外，應盡可能分析多肽鏈的糖鏈結構、寡糖類型(觸角形狀)和糖基化位點。,二、生物學活性測定和比活性,1、意義

9、：1）生物技術產(chǎn)品的化學本質為蛋白質、多肽，其活性由產(chǎn)品的氨基酸序列或其空間結構所形成的活性中心所決定的，與其絕對質量不一致。2）生物技術產(chǎn)品的生物學活性與藥效學基本相一致。3）利用生物學活性建立的測定效價體系，是給藥品定量的依據(jù)，保證產(chǎn)品藥效的重要手段。,有效的效價測定是生物技術原料藥和/或制劑規(guī)范的組成部分。當原料藥采用一種效價測定方法時，其制劑可用另一種方法(物理化學的和/或生物學的)測定。但應提供選擇方法的依據(jù)。,效價測定

10、一般原則:1、國際通用方法；2、測定結果須用國際或國家標準品校正，以國際單位表示。,生物學活性測定方法分類,1）體外細胞培養(yǎng)測定法　 a、促進細胞生長作用（G-CSF:NFS-60）　 b、抑制細胞生長作用 (TNF:L929)　 c、間接保護細胞作用 (IFN:VISH;VSV)2）離體動物器官測定法 采用家兔主動脈條測定重組腦利鈉肽生物活性。3）體內測定法4）生化酶促反應測定法5）免疫學活性測定法,利用動物

11、體內某些指標變化，定出產(chǎn)品的單位，如EPO活性測定，體內注射EPO后，計算小鼠網(wǎng)織紅細胞增加的數(shù)量與標準品比較，確定其活性單位。,基于產(chǎn)品與某種物質的結合或產(chǎn)品本身的化學反應為原理設計，具有簡便、精確、穩(wěn)定等特點，如重組鏈激酶、葡激酶生物活性測定，鏈激酶、葡激酶和纖溶酶原（h-plg）結合形成復合物激活游離h-plg原為有活性的纖溶酶。,利用制品免疫原性，制備相應單克隆抗體或多克隆抗體，采取 ELISA 法測定其含量。,生物學活性測定方

12、法選擇,體內測定和體外測定方法: a、體內測定：即整體動物測定，能為較大范圍的重組產(chǎn)品的效價提供有用信息，但費時、昂貴、難操作及同時存在倫理問題，大多數(shù)情況下傾向于選擇體外測定方法。 b、體外測定：可使用分離的器官或組織、原代細胞或傳代細胞系，目前最常用方法是連續(xù)生長、因子依賴的、克隆化的細胞系的方法，其測定結果比較準確、重現(xiàn)性好、經(jīng)濟、容易使用和便于統(tǒng)計分析。,生物學活性測定方法選擇,2、定量、半定量、定性方法 a、通過研

13、究首先選擇能夠定量評價的方法，最好的選擇是背景較低的反應，并且對相關產(chǎn)品有陡峭的、可重復的劑量-反應曲線；其次考慮半定量方法（如NGF），最后考慮定性（如BMP）方法。 b、對生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，生物學活性測定方法復雜，可采用其他替代方法（如重組人生長激素用HPLC定量方法代替復雜生物活性測定方法）。,細胞培養(yǎng)法中細胞染色標記方法,3H-thymidine、BrdU 是反映DNA合成、增殖細胞數(shù)的比例的。BrdU：首先用BrdU做標記，

14、固定細胞，用核苷酸酶處理后使過氧化物酶結合抗BrdU抗體發(fā)生反應。 MTT（四氮唑鹽）：其在活細胞的線粒體中可以定量地被琥珀酸脫氫酶還原為難溶性的藍紫色結晶物MTT formazan,二甲基亞砜（DMSO）和酸化的異丙醇或酸化的SDS均能溶解紫色結晶物，通過比色法測定MTT formazan的量可以反映線粒體電子傳遞系統(tǒng)機能，間接表示細胞的生長狀態(tài)。,Alamar Blue：氧化型Alamar Blue（600nm

15、）可被活細胞中的線粒體酶還原，還原后染料（570nm）發(fā)生顏色和熒光改變，顏色和熒光的深淺與活細胞數(shù)成正比，可用分光光度計或熒光檢測儀檢測。 Crystal violet：染活細胞后，在比色計中測定光吸收值（A），A值與著染色細胞數(shù)成正比。,,,幾種細胞培養(yǎng)測定方法比較 3H-thymidine BrdU MTT

16、 Alamar Blue靶向物 DNA合成系統(tǒng) 線粒體電子傳遞系統(tǒng)檢出細胞的狀態(tài) 增殖 增殖、生存檢出法 放射活性 色素、熒光 色素 色素、

17、熒光抽出的必要性 + + + -其他試劑的必要性 + ++ + -成本（以MTT為1時）60

18、 80-100（試劑盒） 1 2缺點 使用同位素 不適合 檢出大量未增殖 檢出未增 浮游細胞 細胞，處理時費力 殖活細胞,,,,,,,,,,,,生物

19、學活性測定分析方法,1、用能誘導50%最大反應的待測樣品最高稀釋度作為參考效價（或滴度），或以此稀釋度中所含樣品的量為1單位，即以此稀釋度的倒數(shù)為待測樣品所含的單位數(shù)。 2、比較已知濃度或活性單位樣品標準品和待測樣品的實驗結果。,,,,,,,,活性標準品,待測樣品,稀釋度,a b,A值,生物學測定基本模式圖,蛋白質藥物的比活性測定的意義,1、比活性：每毫克蛋白質的生物學活性單位。2、蛋白質的空間結構不能常規(guī)測定，而它的改變（如

20、二硫鍵的錯誤配對）可影響蛋白質的生物學活性，從而影響藥效，比活性可以反映此種情況。3、比活性可反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定情況，可比較不同表達體系、不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)同一產(chǎn)品時的質量情況。4、比活性是重組蛋白質藥物不同于化學藥的一項重要指標，也是進行成品分裝的重要定量依據(jù)。,生物活性測定標準范圍確定,1、使用驗證過的測定和分析方法，并提供用此方法的效價測定平均值和單測定一批誤差的可信限范圍。2、對于成品的生物活性測定標準，要根據(jù)不同方法的

21、特點規(guī)定相當標示量的范圍，目前，生物活性的測定方法有四類：動物基礎、細胞基礎、生化（酶）法、特異（免疫、受體）結合法。,不同生物活性測定方法的規(guī)定標準表 測定方法 規(guī)定標準動物基礎的生物活性測定 70%～130%標示量細胞基礎的生物活性測定 80%～120%標示量體外酶法的生物活性測定 85%～115%標示量受體結合的生物活性測定

22、 85%～115%標示量,,,,生物學活性效價測定過程中標準品的作用,1、生物學活性測定變異范圍大，同樣制品在不同實驗室測定結果差異很大，必須有一個統(tǒng)一的標準。2、標準品的使用，最大限度地減少實驗室之間和各種影響測定因素地干擾。,物理化學方法取代生物方法的條件,產(chǎn)品的物理化學方法數(shù)據(jù)較完善，并已證實其高級結構。 物理化學與生物試驗之間的關系亦已闡明。 工廠已積累了足夠數(shù)據(jù)，可用物理方法取代。 當產(chǎn)品僅用物理化學

23、方法表示生物活性，結果應用重量表示。 產(chǎn)品出廠檢定，工廠可合理選擇定量方法（生物測定還是物理化學鑒定）,三、蛋白質純度檢查,生物技術原料藥和制劑的絕對純度難以測得，并且所得結果與所用方法有關。原料藥和制劑的純度一般是用幾種方法合并估計的。分析方法的選擇和優(yōu)化主要應考慮的因素是預期產(chǎn)品與產(chǎn)品相關物質和產(chǎn)品雜質的分離。,由于生物技術產(chǎn)品及生物制品的分子特征和獨特的生物合成過程，產(chǎn)品可含有幾種分子實體或變異體。如這些分子實體來源于所預

24、期的翻譯后修飾品，則應作為預期產(chǎn)品的一部分。預期產(chǎn)品在生產(chǎn)和/或儲存過程中形成的變異體，如其性質與預期產(chǎn)品相似，應作為產(chǎn)品相關物質，而不是雜質。對于批檢驗，只需選用一部分適用的方法并闡明其純度測定的合理性。,按WHO規(guī)定必須用HPLC和非還原SDS-PAGE兩種方法測定，其純度都應達到95%以上，有的甚至要求達到99%以上。純度的檢查通常是在原液中進行。方法：非還原SDS-PAGE電泳法、HPLC法、毛細管電泳。,（1）非還原S

25、DS-PAGE電泳法： 1）銀染加樣量≥5ug （1～10ng） 2）考馬斯亮藍R-250 加樣量≥10ug （100ng） 結 果：無明顯雜蛋白帶出現(xiàn)；目標蛋白量應不低于總蛋白量的95%或98%。蛋白質樣品在荷質比均一。,（2）HPLC法：分子篩、反相層析，離子交換層析，盡量采用與SDS-PAGE原理不同的反相或離子交換層析，不主張用分子篩分析。 （3）毛細管電泳：簡便

26、、快速、靈敏度和分辨率高；價格高、重現(xiàn)性差。,,幾種檢定重組蛋白純度方法的比較特性 HPLC SDS-PAGE、IEF CE分離機制 極性、非極性分配， 電荷、等電點 電荷等 分子大小、離子交換 分析所需時間 10～120mi

27、n 幾小時 10～30min 分辨力 好 好 好樣品體積 10～50ul 1～50ul

28、1～50nl 靈敏度范圍 ng ～ug ng～ug pg 定量準確性 + ± +分析方式 紫外、熒光、折射 紫外（可見、

29、熒光） 同HPLC 電化學、放射性 銀染、放射自顯影儀器價格 中～高 低 中～高日常消耗 低 高

30、 低自動化 中～高 低 中～高人力操作 低 高 低制備級

31、 中 中 微量級制備收集樣品 可以 可以 較困難,,,,,用于研究蛋白質純度的方法和機制 方法 分析機

32、制 反相HPLC 疏水性 疏水性相互作用HPLC 疏水性 毛細管電泳 荷質比 離子交換HPLC 電荷 等電聚焦 電荷 聚丙烯酰胺凝膠電泳 電荷比 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 電荷，分子大小 分子排阻HPLC

33、 分子大小 質譜測量法 分子大小,,,,四、蛋白質含量測定,一般采用蛋白質的含量測定。在產(chǎn)品以效價表示時，不必另測含量。有時還要證明所得量值直接與生物測定值相關。如已證實相關性，在生產(chǎn)過程中可測定含量而不測定生物活性。,可根據(jù)物理化學性質采用Folin-酚試劑法（Lowry法）、染色法（Bradford法）、雙縮脲法、紫外吸收法、HPLC法和凱氏定氮等方法。,Folin-酚試劑法：

34、磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，藍色深度與蛋白的量成正相關。靈敏范圍：5～100ug/ml；優(yōu) 點：簡便、靈敏度較高；不同蛋白質間的變異少；缺 點：受多種物質干擾，反應速度慢，某些試劑不穩(wěn)定。,Bradford法是采用考馬斯亮藍-G250與蛋白質結合的原理，迅速、靈敏的定量測定蛋白質的方法；靈敏范圍：25～200ug/ul，需要時間：10min。,紫外

35、吸收法:蛋白質分子中常含有酪氨酸(275nm)、色氨酸(280nm)、苯丙氨酸(257nm)等苯環(huán)結構，在紫外280nm波長處有最大吸收峰，其光吸收值與蛋白質濃度成正比，故可以用280nm波長吸收值大小來測定蛋白質含量。靈敏范圍：0.2～2mg/ml簡單、省時受光吸收物質影響蛋白濃度（mg/ml）﹦1.55A280-0.76A260,,蛋白質常用的定量方法的比較方法 所需蛋白質 破壞 蛋白質/蛋白 技

36、術 方法的變異 的量（mg/ml） 與否 質變化情況 復雜性 系數(shù)（%）雙縮脲 0.5～5 是 少 簡單、快速 5Lowry 0.05～5 是 中等 顯色慢、試劑多 5凱氏定氮 0.05～3 是 少 干擾、復雜、慢 0.154紫外吸收法

37、 0.05～2 否 大 簡單、快速、 0.439（280nm） 干擾物質多染料結合法 0.01～0.05 是 中等 簡單、快速 3.75熒光法 0.001～0.01 否 中等 較易 3.75,,,,五、蛋白質藥物理化性質的鑒定,分子量及分

38、子大小異構體消光系數(shù)(克分子吸收系數(shù))電泳圖譜液相色譜圖光譜圖等電點測定,1、分子量及分子大小測定,還原型SDS-PAGE：蛋白質在SDS和β-巰基乙醇存在下沸水浴5min，形成表面帶大量負電荷的桿狀分子，降低了分子形態(tài)和電荷的影響，在電泳過程中蛋白遷移率基本只與其相對分子質量相關。凝膠過濾（分子篩）法：根據(jù)蛋白分子大小和性狀進行測定。質譜法：根據(jù)荷質比進測定。,2、異構體,用等電聚焦或其他適宜的技術（反相色譜）測定。,

39、3、消光系數(shù)(克分子吸收系數(shù)),一般應在特定的紫外/可見光波長(如280nm)條件下測定預期產(chǎn)品的消光系數(shù)。消光系數(shù)是用已知蛋白質量(用氨基酸組分分析或定氮法測得)的產(chǎn)品溶液，用紫外/可見分光光度計測定。如產(chǎn)品用紫外/可見分光光度測定其蛋白質含量，則必須采用消光系數(shù)法。,4、電泳圖譜,產(chǎn)品的電泳圖及其鑒別，可用聚丙烯胺凝膠電泳、等電聚焦、SDS—聚丙烯胺凝膠電泳、Western Blot、毛細管電泳或其他適宜的方法測得。,5、液相色譜

40、圖,產(chǎn)品的色譜圖及產(chǎn)品的鑒別、同質性和純度的資料，可用分子排阻色譜、反向液相色譜、離子交換液相色譜、親和層析或其他適宜的技術方法測定。,6、光譜圖,可測定產(chǎn)品的紫外吸收光譜。對某一重組蛋白質來說，其最大吸收波長是固定的。在生產(chǎn)工程中每批產(chǎn)品的紫外吸收光譜應當一致。重組產(chǎn)品一級結構不含芳香族氨基酸，可不做紫外吸收光譜測定。,對于產(chǎn)品的高級結構需用圓二色性、磁共振和其他適宜的技術測定。,7、等電點測定,重組蛋白質藥物的等電點往往是不均

41、一的，但在生產(chǎn)過程中批與批之間的電泳結果應一致，以說明其生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。方法：等電聚焦電泳法(IEF) 毛細管電泳法。,六、免疫化學性質,當產(chǎn)品是抗體時，對其免疫性質應全面鑒定。用抗體與純化抗原和抗原特定區(qū)結合試驗來確定親和力、親和性和免疫反應性(包括交叉反應性)。如條件許可，應用生化方法確定抗原表位和帶有相關抗原表位的靶分子。對于有些原料藥和制劑，需用抗體識別蛋白分子不同表位的免疫化學方法(如ELISA，We

42、stern Blot)檢測蛋白分子蛋白質的免疫化學性質可用于鑒別、均一性或純度測定，也可用于定量。,工藝相關雜質是指生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的雜質，如細胞基質(宿主細胞蛋白、宿主細胞DNA)、細胞培養(yǎng)物(誘導劑、抗生素或培養(yǎng)基成分)或下游工序產(chǎn)生的雜質。,七、殘余雜質檢測,1、對殘余雜質進行限制的意義 a、殘余雜質可能具有毒性，引起安全性問題； b、可能影響產(chǎn)品的生物學活性和藥理作用，或使產(chǎn)品變質； c、反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的

43、穩(wěn)定性。,2、生產(chǎn)工藝相關雜質和污染物,宿主細胞蛋白含量宿主細胞DNAIgG含量（10ng/劑量）蛋白A含量小牛血清殘留量殘余抗生素（氨芐西林）內毒素含量（LAL）污染物,（1）宿主細胞蛋白含量,以雙抗體夾心ELISA為宜，盡量不用斑點免疫。常采用5種最常用的E.coli菌株混和作為ELISA測菌體蛋白含量的通用標準。不同表達體系對菌體蛋白含量標準不同。 來自E.coli菌株的產(chǎn)品為不大于0.1%；來自CHO細胞的

44、產(chǎn)品為不大于0.05%。,（2）宿主細胞DNA,測定方法：采用DNA雜交實驗，用固相斑點雜交法，以地高辛標記檢測試劑盒或者用同位素標記DNA探針進行測定，必須提供相應宿主細胞DNA標準品?，F(xiàn)行生物制品規(guī)程對宿主細胞DNA殘留量標準作了相應調整： 由小于100pg/劑量調整為小于10ng/劑量。宿主細胞DNA只作為一種細

45、胞污染因素不作為一種危險因素。,,（3）污染物,產(chǎn)品污染物是指帶入的外源性物質而不是生產(chǎn)工藝的一部分，如化學及生化物質(微生物蛋白酶)和/或微生物。應嚴格避免污染物，并用合適的認可標準或內控限值來控制其限度。外源性病毒和支原體污染。,產(chǎn)品相關雜質(如前體、某些降解產(chǎn)物)是在生產(chǎn)和/或貯存過程中產(chǎn)生的分子變異體，這些變異體在活性、有效性及安全性方面與預期產(chǎn)品相比，不占主導地位。,3、產(chǎn)品有關雜質,截短式（Truncated forms

46、），蛋白質/多肽中失去氨基酸或內部裂解。 去酰胺化，異構化，S－S鏈誤聯(lián)，氧化形式等。 聚合類雜質，包括雙聚體、多聚體。,八、安全性及其他檢測項目,無菌試驗熱源試驗異常毒性試驗免疫原性檢查水分、裝量、pH檢測,幾種生物技術藥物檢驗項目表,幾種生物技術藥物檢驗項目表,幾種生物技術藥物檢驗項目表,幾種生物技術藥物檢驗項目表,由免疫細胞及非免疫細胞 經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有多 種生物活性的小分子蛋白質,第二節(jié)、細胞因子

47、（Cytokine）,已批準上市的細胞因子生物技術藥物,細胞因子的來源,活化的免疫細胞：淋巴細胞尤其是T細胞、單核細胞/巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞等?；|細胞類：血管內皮細胞、成纖維細胞、上皮細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質細胞等。某些腫瘤細胞。,二、細胞因子的共同特性,（一）結構特點:*屬低分子量（6-60kD）的多肽或糖蛋白*分型：分泌型和跨膜型（TNF；TGF-α；SCF）*存在形式：單體(IL-1,2等)；二聚體（IL-5，

48、12）；三聚體（TNF)。,功能：與調節(jié)免疫應答、造血功能和炎癥反應有關。作用方式:自分泌、旁分泌和內分泌；,76,CKs的共同特性及作用特點：1）高效性： 靶細胞-受體；高親和力結合2）分泌性： 旁分泌、自分泌、內分泌；短時自限3）多效性： 一CK多靶多效4）重疊性： 多CK一靶一效5）協(xié)同性： 一CK強化它CK6）拮抗性： 一CK抑制它CK7）網(wǎng)絡性： 多CK互相平衡8）同源性和多源性,多效性,重疊性,協(xié)同,拮抗,

49、Cascade induction,網(wǎng)絡性,NK1+T,,,,,,,,,,IL- 4,,骨髓基質細胞,IL-1 IL-6 IL-7 SCF,,造血干細胞,IL-1 IL-6 IL-11 TNF-a GM-CSF G-CMF M-CSF,單核細胞,中性粒細胞,嗜酸性粒細胞,,IL-1 IL-8 TNF-a,IL-1 TNF-a,,,IL-10 IL- 4,,IL- 4 IL-6,,IL-10 IL-13 IL-4 TGF-b

50、,,,IL-4 IL-5 IL-6 IL-13 IL-10 TGF-b,,IL-4,IL-4,內皮細胞,,IL-4,,IL-4,,IL-2 IFN-g,,IL-10 IL-13 IL-4,NK 細胞,,IFN-g,,IL-2,,IL-2 IFN-g,,IL-2,,IL-2 IL-12,,G-CMF IFN-g GM-CSF,IL-12,,,IL-1 TNF-a TGF-b PDGF FGF,M-CSF GM-CSF,,

51、內皮細胞,纖維母細胞,下 丘 腦,,IL-1 TNF-a,M-CSF GM-CSF,,,IL-1 IL-6 TNF-a,,,IL- 4,IL- 6,IL- 4,三 細胞因子的功能分類,干擾素(Interferon, IFN)白細胞介素(interleukin, IL)集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)生長因子(Gro

52、wth factor, GF)趨化因子(chemokine CK),一、干擾素（interferon; IFN）,干擾素是由病毒和其他種類的干擾素誘導劑，通過刺激網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)（人體免疫系統(tǒng)的一種）、巨噬細胞、淋巴細胞以及體細胞所產(chǎn)生的一種糖蛋白。這種蛋白具有多種生物活性，包括抗增殖、免疫調節(jié)、抗病毒和誘導分化作用。 根據(jù)分子結構和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個類型。,現(xiàn)狀,目前可供臨床選用的干擾素種類很多。例如國產(chǎn)重組 IFN

53、－α1型和IFN－α2型，進口的干擾能（IFN－α2b）、干擾素（ IFN－α2a）、惠福仁（類淋巴母細胞干擾素）及組合干擾素等等。,干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）,體外誘生干擾素制備工藝： Sendai病毒誘導人白細胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批準上市產(chǎn)量低：1g IFNα，需要 3億ml人血白細胞來源困難，工藝復雜，收率低，價格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性,干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）,人源轉化細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工

54、藝： 1999年：IFN α-n1/Wellferon, 批準用于臨床。 優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。 缺點： 活性低，退出臨床應用。,干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）,上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表達產(chǎn)物：無糖基化，N

55、-met，無活性包涵體工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復性過程。,基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:,干擾素生產(chǎn)工藝路線（4）,上市產(chǎn)品：rhuIFN β-1a1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono)表達產(chǎn)物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku工藝特點：分泌表達，產(chǎn)量低，成本高,過程嚴格,動物無限細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：,干擾素生產(chǎn)工藝路線（5）,?宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudom

56、onas putida）?上市產(chǎn)品：IFN α-2b/安福隆?表達產(chǎn)物：無糖基化可溶性蛋白質，具有天然分子結構和生物活性?工藝特點：發(fā)酵周期短：幾個小時無需變性、復性過程，獲得有活性產(chǎn)品純化過程：淘汰抗體親和層析,基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:,半成品檢定,（1）效價測定 用細胞病變抑制法，以Wish細胞、VSV病毒為基本檢測系統(tǒng)，測定中必須用國家或國際參考品校準為國際單位。（2）蛋白質含量測定 福林

57、-酚法，以中國藥品生物制品檢定所提供的標準蛋白為標準。（3）比活性 效價的國際單位與蛋白質含量的毫克數(shù)之比。（4）純度 電泳純度用非還原型SDS-PAGE法，銀染顯色應為單一區(qū)帶，經(jīng)掃描儀測定純度應在95%以上。,（5）相對分子量測定 還原型SDS-PAGE，加樣量不地域微克，同時用已知相對分子量的蛋白標準系列做對照，以遷移率為橫坐標，相對分子量的對數(shù)為縱坐標作圖，計算相對分子量。與理論值比較，誤差不

58、得高于10%。（6）殘余外源性DNA含量測定 用放射性核素或生物素探針法測定，每劑量中殘余外源性DNA應低于100pg。（7）殘余血清IgG含量測定 在應用抗體親和層析法作為純化方法時必須進行此項檢定。（8）殘余抗生素活性測定 半成品中不應有抗生素活性存在。,（9）紫外光譜掃描 檢查半成品的光譜吸收值，最大吸收值應在280±2納米。（10）肽圖測定 用CNBr裂

59、解法，測定結果應符合干擾素的結構，且批與批之間應一致。（11）等電點測定 等電聚焦電泳。（12）除菌半成品應做干擾素效價測定、無菌試驗和熱源質試驗。,成品檢定,（1）物理性狀 凍干品白色或微黃色疏松體，加入注射水后不得含有肉眼可見不溶物。（2）鑒別試驗 應用ELISA或中和試驗檢定。（3）水分測定 用卡氏法，應低于3%。（4）無菌試驗 同半成品。,（5）熱原質試