1、實時熒光定量PCR技術(shù)原理及其儀器分析,,PCR,1983年 Cetus公司的Kary Mullis于12月16日第一次成功實驗發(fā)明了PCR，并于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎1995年 Perkin Elmer 公司研制出熒光定量PCR技術(shù)九十年代中期 PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面展開1998年 熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測,PCR之父Mullis,,循環(huán)次數(shù)

2、 DNA的鏈數(shù) 1 　 21 2 2 　22 4 3 　 23 8 10 　 210

3、 1024 20 　220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10億,PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關(guān)系,PCR特點：高效擴增、忠實復(fù)制,實時熒光定量PCR,在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)

4、曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法,,基線（Baseline）熒光域值（threshold）循環(huán)閾值(Ct),,,熒光標(biāo)記與探針類型,水解型探針：TaqMan探針分子信標(biāo)SYBR Green I DNA結(jié)合染料雜交探針蝎子引物法LUX引物,非特異性熒光標(biāo)記： 1、 SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan 3、Molec

5、ular Beacon,SYBR Green,SYBR Green 法工作機理,SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位,SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 變性時，DNA雙鏈分開，無熒光 復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。,,SYBR Green,,,,起始模板的測定基因型的分析融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對常規(guī)PCR有指

6、導(dǎo)意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。,,TaqMan法,TaqMan---水解型雜交探針,5′端標(biāo)記有報告基團(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團 (Quencher, Q) 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針,,每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號

7、，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光,分子信標(biāo)法,標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針 環(huán)與目標(biāo)序列互補莖由互補配對序列組成,發(fā)夾型雜交探針,應(yīng)用范圍,起始模板的定量 基因型分析 產(chǎn)物鑒定 SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析,熒光PRC的系統(tǒng)結(jié)構(gòu),熱模塊系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng),熒光檢測系統(tǒng)分析系統(tǒng),熱模塊系統(tǒng),,半導(dǎo)體,空氣離心,光學(xué)系統(tǒng),熒光檢測系統(tǒng),CCDPMT，光電二極管，掃描機制PMT，光電二極管，旋轉(zhuǎn)機制,分析系統(tǒng),SDS軟件,使用方

8、法,,使用注意事項,1. 按照正確的開關(guān)機順序操作2. 應(yīng)該定期備份的實驗數(shù)據(jù)3. 良好的實驗室環(huán)境,常見問題,判斷樣本加熱塊是否被污染 不正常的高信號 → 污染 某個孔的信號明顯高出其他孔 → 污染清除樣本加熱塊污染 乙醇→去離子水→蒸發(fā),熒光定量PCR的定量分析是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的每個標(biāo)本的Ct值進(jìn)行的。在獲得各個標(biāo)本的PCR擴增曲線后，計算機軟件自動確定用于定量分析的Ct值。,Q-PCR分析,采用已知物的

9、標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量未知目的物。,標(biāo)準(zhǔn)曲線定量,拷貝數(shù)=,DNA摩爾質(zhì)量,DNA質(zhì)量（g）,x 6.02 x 10,23,______________,相對定量分析,用目的基因與對照基因進(jìn)行樣品間的比較。通過從目的基因的Ct減去對照基因Ct獲得相對于對照基因的定量，循環(huán)數(shù)差別是基數(shù)2的指數(shù)，表示這兩個基因的模板倍數(shù)差別。,PCR效率（E）=,10 -1,(-1/S),標(biāo)準(zhǔn)曲線制作,已知基因DNA,質(zhì)粒載體,RNA樣品,PCR

10、,RNA樣品濃度,克隆,DNAase,光密度儀,縱坐標(biāo)：Ct 橫坐標(biāo)：lgRNA模板數(shù),RNA拷貝數(shù),熒光PCR的局限性,在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中，由于無一統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各實驗室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品不相同，使實驗結(jié)果缺乏可比性。在相對定量中，其前提是假設(shè)內(nèi)源控制物不受實驗條件的影響的，合理地選擇合適的不受實驗條件影響的內(nèi)源控制物是實驗結(jié)果可靠與否的關(guān)鍵。,與傳統(tǒng)PCR相比的不足之處,（1）由于運用了封閉的檢測，減少了擴增后電泳的檢測步驟，