1、實時熒光定量PCR技術原理及其儀器分析,,PCR,1983年 Cetus公司的Kary Mullis于12月16日第一次成功實驗發(fā)明了PCR，并于1993年獲得諾貝爾化學獎1995年 Perkin Elmer 公司研制出熒光定量PCR技術九十年代中期 PCR臨床應用在國內全面展開1998年 熒光定量PCR技術開始在中國應用于臨床檢測,PCR之父Mullis,,循環(huán)次數(shù)

2、 DNA的鏈數(shù) 1 　 21 2 2 　22 4 3 　 23 8 10 　 210

3、 1024 20 　220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10億,PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產量關系,PCR特點：高效擴增、忠實復制,實時熒光定量PCR,在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準

4、曲線對未知模板進行定量分析的方法,,基線（Baseline）熒光域值（threshold）循環(huán)閾值(Ct),,,熒光標記與探針類型,水解型探針：TaqMan探針分子信標SYBR Green I DNA結合染料雜交探針蝎子引物法LUX引物,非特異性熒光標記： 1、 SYBR Green 特異性熒光標記： 2、TaqMan 3、Molec

5、ular Beacon,SYBR Green,SYBR Green 法工作機理,SYBR Green 能結合到雙鏈DNA的小溝部位,SYBR Green 只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光 變性時，DNA雙鏈分開，無熒光 復性和延伸時，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。,,SYBR Green,,,,起始模板的測定基因型的分析融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應的條件，對常規(guī)PCR有指

6、導意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產物、多種產物。,,TaqMan法,TaqMan---水解型雜交探針,5′端標記有報告基團(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端標記有熒光淬滅基團 (Quencher, Q) 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針,,每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號

7、，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光,分子信標法,標記熒光的發(fā)夾探針 環(huán)與目標序列互補莖由互補配對序列組成,發(fā)夾型雜交探針,應用范圍,起始模板的定量 基因型分析 產物鑒定 SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析,熒光PRC的系統(tǒng)結構,熱模塊系統(tǒng)光學系統(tǒng),熒光檢測系統(tǒng)分析系統(tǒng),熱模塊系統(tǒng),,半導體,空氣離心,光學系統(tǒng),熒光檢測系統(tǒng),CCDPMT，光電二極管，掃描機制PMT，光電二極管，旋轉機制,分析系統(tǒng),SDS軟件,使用方

8、法,,使用注意事項,1. 按照正確的開關機順序操作2. 應該定期備份的實驗數(shù)據(jù)3. 良好的實驗室環(huán)境,常見問題,判斷樣本加熱塊是否被污染 不正常的高信號 → 污染 某個孔的信號明顯高出其他孔 → 污染清除樣本加熱塊污染 乙醇→去離子水→蒸發(fā),熒光定量PCR的定量分析是根據(jù)標準曲線的每個標本的Ct值進行的。在獲得各個標本的PCR擴增曲線后，計算機軟件自動確定用于定量分析的Ct值。,Q-PCR分析,采用已知物的

9、標準曲線來定量未知目的物。,標準曲線定量,拷貝數(shù)=,DNA摩爾質量,DNA質量（g）,x 6.02 x 10,23,______________,相對定量分析,用目的基因與對照基因進行樣品間的比較。通過從目的基因的Ct減去對照基因Ct獲得相對于對照基因的定量，循環(huán)數(shù)差別是基數(shù)2的指數(shù)，表示這兩個基因的模板倍數(shù)差別。,PCR效率（E）=,10 -1,(-1/S),標準曲線制作,已知基因DNA,質粒載體,RNA樣品,PCR

10、,RNA樣品濃度,克隆,DNAase,光密度儀,縱坐標：Ct 橫坐標：lgRNA模板數(shù),RNA拷貝數(shù),熒光PCR的局限性,在標準曲線定量中，由于無一統(tǒng)一標準，各實驗室所用的生成標準曲線的樣品不相同，使實驗結果缺乏可比性。在相對定量中，其前提是假設內源控制物不受實驗條件的影響的，合理地選擇合適的不受實驗條件影響的內源控制物是實驗結果可靠與否的關鍵。,與傳統(tǒng)PCR相比的不足之處,（1）由于運用了封閉的檢測，減少了擴增后電泳的檢測步驟，