1、目的:
　　1.收集臨床分離銅綠假單胞菌，利用特異性PCR檢測(cè)qnrVC基因在菌株中的流行情況，并獲得其全序列和亞型信息。
　　2.以MLST與PFGE為主要方法，分析qnrVC陽(yáng)性菌株的同源性，以獲得qnrVC基因在臨床菌株中流行與傳播的克隆特征。
　　方法:
　　1.臨床分離菌株收集
　　收集來自廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院、廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及佛山市第一人民醫(yī)院、順德區(qū)第一人民

2、醫(yī)院臨床分離銅綠假單胞菌1313株；并同時(shí)收集菌株臨床信息及藥敏結(jié)果進(jìn)行分析。
　　2.qnrVC基因的篩選與基因亞型的確認(rèn)
　　將收集菌株在血平板上進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，用煮沸法提取細(xì)菌總DNA，用qnrVC基因特異性篩選引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出qnrVC陽(yáng)性菌株。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，用qnrVC全序列引物對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送DNA測(cè)序，測(cè)序后序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知qnrVC亞

3、型序列比對(duì)，確認(rèn)qnrVC基因的亞型。
　　3.qnrVC陽(yáng)性菌株同源性分析
　　利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取qnrVC陽(yáng)性菌株基因組DNA，然后按照MLST數(shù)據(jù)庫(kù)推薦的七對(duì)引物進(jìn)行管家基因片段的PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增序列測(cè)序后提交至銅綠MLST數(shù)據(jù)庫(kù)，可以得出各菌株的ST型。ST型數(shù)據(jù)用eBurst軟件分析，可以得出qnrVC基因陽(yáng)性株之間的同源性及是否存在克隆復(fù)合體及暴發(fā)流行。對(duì)qnrVC陽(yáng)性菌株細(xì)
　　菌總DNA

4、用限制性內(nèi)切酶Xbal I進(jìn)行酶切，通過PFGE電泳，得到各菌株P(guān)FGE條帶，使用BioNumberics軟件分析結(jié)果并構(gòu)建進(jìn)化樹，從而分析其同源性及克隆株。
　　結(jié)果:
　　1.（1）1313株銅綠假單胞菌中共檢出20株銅綠假單胞菌含有qnrVC基因，陽(yáng)性率約為1.5％，其中18株來自廣州地區(qū)，2株分離自湛江地區(qū)，均為住院患者，其中重癥醫(yī)學(xué)科患者9例，占45%；呼吸科病人4例，占20%，其余患者3例來自外科，泌尿外科1例，

5、婦科1例，心臟監(jiān)護(hù)室1例，綜合病區(qū)1例。陽(yáng)性菌株來源患者性別分布無差異，年齡平均為68.7±10.9歲。
　?。?）分析所有入選的銅綠假單胞菌對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為16.6%、15.4%，MIC濃度主要集中在0.25-0.5μg/ml和0.5-1μg/ml；而20株qnrVC陽(yáng)性菌株的環(huán)丙沙星與左氧氟沙星的敏感性分別為44.4%、38.9%，MIC值集中于4μg/ml與8μg/ml。
　?。?）qnrVC基因全

6、序列擴(kuò)增成功，測(cè)序并比對(duì)所得序列與已知qnrVC基因亞型，發(fā)現(xiàn)其中分離自廣州地區(qū)的18株qnrVC基因?yàn)閝nrVC6亞型，2株來自湛江地區(qū)菌株為qnrVC1亞型。
　　2.20株qnrVC陽(yáng)性銅綠假單胞菌可分為11個(gè)ST型，其中ST1182型4株（重癥醫(yī)學(xué)科2例，心臟監(jiān)護(hù)1例，婦科1例），ST389型4株（重癥醫(yī)學(xué)科3例，外科1例），ST455型3株（重癥醫(yī)學(xué)科2例，綜合區(qū)1例），ST274型2株，ST360型、ST303型、ST

7、1337型、ST1661型、ST277型、ST1075型各一株，另有未定型ST一株。
　　3． PFGE結(jié)果顯示，ST389型、ST455型及ST274型電泳條帶不同，即PFGE分型不一致；而A1、A2和A3菌株P(guān)FGE分型一致，結(jié)合三例患者臨床資料確定此三株菌為ST1182型克隆株。
　　結(jié)論:
　　1.qnrVC基因已開始在銅綠假單胞菌臨床分離菌株中傳播；其中高齡重癥患者為高危人群。qnrVC基因的存在可引起銅綠假

8、單胞菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥率上升。
　　2.本研究在廣州地區(qū)分離株中檢出qnrVC6亞型（18株），而湛江地區(qū)則檢出qnrVC1亞型（2株），初步證明qnrVC基因的流行具有區(qū)域性和多樣性。
　　3. qnrVC陽(yáng)性銅綠假單胞菌型別分布比較分散(11種ST型)，未呈集中趨勢(shì)，亦未檢測(cè)出易引起暴發(fā)的ST型（ST244、ST235、ST357），說明目前本研究區(qū)域尚未出現(xiàn)qnrVC陽(yáng)性銅綠假單胞菌某一克隆株的暴發(fā)流行。其中 ST3