1、選題依據(jù)：款冬花是菊科植物款冬(Tussilago farfara L.)的干燥花蕾。具有潤(rùn)肺下氣、止咳化痰的功效。目前對(duì)款冬有效部位的研究還處于初步階段，其止咳化痰有效部位尚不清楚?；瘜W(xué)方面，款冬花含量測(cè)定方法有一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但仍然存在耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)成分不多的問(wèn)題，款冬葉的含量測(cè)定方法尚未建立?？疃参镏杏悬S酮，倍半萜等多類化學(xué)成分，其合成的上游通路比較清晰，但這些成分合成的下游通路都有各自的規(guī)律，研究的較少。因此，本論文對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)

2、行了探究，以期為款冬在藥理，化學(xué)，生物方面的研究提供依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。
　　目的：1，通過(guò)敲出法尋找款冬發(fā)揮止咳化痰作用的化學(xué)有效部位。2，建立款冬花的UPLC含量測(cè)定方法，測(cè)定9月至11月之間四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的款冬花中12種化學(xué)成分的含量，為款冬花蕾合理采摘提供依據(jù)，測(cè)定20批不同產(chǎn)地，不同栽培方式款冬藥材中12種成分的含量，為款冬藥材的合理選用提供依據(jù)。3，建立UPLC測(cè)定款冬葉中8種化學(xué)成分含量的方法，測(cè)定5月至10月之間7個(gè)時(shí)間點(diǎn)

3、款冬葉中這些成分的含量，為款冬葉的采集提供依據(jù)。4，基于高通量測(cè)序的款冬葉和花的轉(zhuǎn)錄組研究，為其分子生物研究提供數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　1.通過(guò)氨水引咳實(shí)驗(yàn)，辣椒堿引咳實(shí)驗(yàn)，小鼠祛痰模型對(duì)敲出后的款冬水提物進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。
　　2.建立超高效液相色譜（UPLC）法測(cè)定款冬花中12種成分含量，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的款冬花蕾中這些成分的含量，對(duì)這些成分的變化規(guī)律進(jìn)行分析，測(cè)定20批款冬花中這些成分的含量，探究不同產(chǎn)地這些成分存

4、在的相似性和差異性。
　　3.通過(guò)固相萃取(SPE)結(jié)合超高效液相色譜（UPLC）建立款冬葉的含量測(cè)定方法，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)款冬葉中這些成分的含量并挖掘其變化特征。
　　4.基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)款冬葉和花蕾中轉(zhuǎn)錄組信息，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)挖掘其中信息，找出與細(xì)胞功能相關(guān)的基因序列和參與黃酮類成分合成的基因序列。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)款冬水提物中缺失正丁醇部位的化學(xué)成分，其止咳化痰作用明顯下降，反證正

5、丁醇部位為其有效部位。結(jié)合UPLC和NMR對(duì)不同部位的化學(xué)成分進(jìn)行指認(rèn)，指認(rèn)出42個(gè)化合物。正丁醇部位所含的化合物主要有：蘆丁，金絲桃苷，異綠原酸B，異綠原酸C，異綠原酸A，槲皮素等化學(xué)成分。
　　2.通過(guò)UPLC對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的款冬花進(jìn)行含量測(cè)定，在款冬花生長(zhǎng)的9-11月這段時(shí)間當(dāng)中，沒(méi)食子酸，咖啡酸，金絲桃苷，款冬酮，甲基丁酰-3,14-去氫-Z-款冬素酯這幾個(gè)成分隨著款冬花的生長(zhǎng)含量升高，綠原酸，蘆丁成分隨著生長(zhǎng)含量變化不大

6、，異綠原酸B，異綠原酸A，異綠原酸C，隨著生長(zhǎng)含量有所降低；不同成分的含量變化并不一致并且變化范圍也不同，黃酮類和萜類成分的含量變異系數(shù)較大，而綠原酸類成分的變異系數(shù)相對(duì)較小。通過(guò)其化學(xué)成分含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期款冬中含量高的成分并不一致，因此款冬的采收要根據(jù)需要的化學(xué)成分，以及不同時(shí)期樣本的藥效來(lái)綜合考慮。不同栽培方式的款冬花同樣存在差異差異，且栽培方式間的差異大于產(chǎn)地之間的差異。含量測(cè)定結(jié)果顯示，野生品款冬花藥材中綠原酸，蘆丁，金絲桃

7、苷等成分含量高于栽培品。黃酮類成分的變異系數(shù)大于其他成分。
　　3.結(jié)合固相萃取（SPE）和超高效液相色譜（UPLC）技術(shù)對(duì)不同時(shí)期的款冬葉進(jìn)行含量測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)款冬葉在5-11月這段時(shí)間中，綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，的含量在初期升高，到達(dá)頂點(diǎn)后會(huì)下降，而化合物咖啡酸隨著時(shí)間的推移，含量會(huì)越來(lái)越低，化合物蘆丁在初期含量很低，而隨著時(shí)間的推移，含量逐漸升高。不同成分變化范圍方面，萜類成分的含量變異系數(shù)較大，咖啡酸變

8、異系數(shù)最低，而款冬葉子的采集需要根據(jù)含量測(cè)定的數(shù)據(jù)，結(jié)合葉子的生長(zhǎng)狀況，葉子的用途等因素進(jìn)行綜合考慮。
　　4.對(duì)款冬葉和花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示款冬葉得到31227條Unigenes，最長(zhǎng)的為11 Mb；款冬花蕾得到34668條Unigenes，最長(zhǎng)的為15 Mb，通過(guò)kegg蛋白庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，找出黃酮合成過(guò)程中上游途徑中13個(gè)酶的基因序列和下游途徑中的序列。
　　結(jié)論：發(fā)現(xiàn)款冬的止咳化痰有效部位為其正丁醇部位