1、目的：
　　煙霧吸入性損傷的病死率高，發(fā)病機制復雜，主要是肺內炎癥細胞膜上的NF-κB信號通路激活，誘導大量細胞因子釋放，促使炎癥反應失控，導致ALI/ARDS的發(fā)生。miRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA，可識別結合靶基因的3ˊ-UTR，導致mRNA降解或抑制翻譯。miR-146a通過靶向TRAF6和IRAK1阻斷NF-κB活化，負向調控炎癥反應。一個miRNA可以調控多個靶基因，在煙霧吸入性損傷發(fā)生發(fā)展過程中， miR-146

2、a是否靶定TMEM33來減輕肺內炎癥反應，國內外未見報道?；诖?，本實驗依據miR-146a預測靶點構建熒光素酶報告基因重組質粒并進行功能驗證，通過小鼠煙霧損傷模型觀察miR-146a對炎癥因子和蛋白表達水平的影響，試圖證實miR-146a通過靶向TMEM33減輕肺部炎癥反應，提高ALI/ARDS的治療效果。
　　方法：
　　1.利用生物學軟件TargetScan和miRanda預測TMEM33 mRNA3ˊ-UTR區(qū)可能是

3、miR-146a的作用靶點，構建含TMEM33 mRNA3ˊ-UTR熒光報告質粒，雙熒光素酶活性檢測驗證miR-146a與TMEM33的標靶關系；
　　2.選擇SPF級C57小鼠20只，雌雄不限，建立小鼠煙霧吸入性損傷模型，隨機分為正常對照組、煙霧致傷+生理鹽水組、煙霧致傷+miR-146a組、煙霧致傷+miR-control組，每組5只，煙霧吸入性損傷24h后處死小鼠取肺組織，右肺采用HE染色檢測肺損傷程度；采用探針PCR檢測各

4、組miR-146a的相對表達量，采用熒光定量PCR檢測各組TNF-α、IL-1和靶基因mRNA的表達；左肺行Western實驗檢測各組COX-2和TMEM33蛋白的水平。
　　結果：
　　1. TargetScan等軟件預測顯示miR-146a與TMEM33mRNA3ˊ-UTR存在互補結合位點，構建的熒光素酶報告質粒經酶切及測序鑒定正確；雙熒光素酶報告基因檢測系統顯示，與pMIR-TMEM33+miR-control組相比，

5、pMIR-TMEM33+miR-146a mimics組熒光素酶活性降低62％左右，差異有統計學意義（P<0.01）；而pMIR-TMEM33-mu+miR-146a組熒光強度無明顯差異（P>0.01）；
　　2. HE染色顯示正常對照組小鼠肺組織無明顯異常，煙霧致傷組小鼠肺部出現中重度的炎細胞浸潤及出血等；TaqMan RT-qPCR結果顯示，相對于miR-control組miR-146a的表達量（0.829±0.060），mi

6、R-146a組的表達量（11.640±0.190）上調了約10倍（P<0.01）；RT-qPCR結果顯示，miR-146a組TNF-α和IL-1mRNA的表達顯著低于生理鹽水組和miR-control組（P<0.01）；而TMEM33的表達與生理鹽水組及miR-control組相比無顯著性差異（P>0.05）；Western Blot結果顯示，與生理鹽水組和miR-control組相比，miR-146a組COX-2及TMEM33表達相對