1、目的:肺癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，在中國，其死亡率和發(fā)病率都很高，而生存率卻很低，其中女性5年生存率僅為16.1％。研究表明，血液中存在的一些蛋白質(zhì)等生物大分子可以為肺癌的早診、早治、耐藥反應(yīng)、預(yù)后等結(jié)局事件提供關(guān)鍵信息，從而提高癌癥的早診率和促進臨床醫(yī)生給患者制定更有效的治療措施。這些生物大分子一般稱為生物標志物。近年來研究表明，人類血液中的一些小RNA也起到生物標志物的作用。mi croRNA是一類非編碼的RNA序列，具有內(nèi)源性

2、、片段小等特點。它們主要通過與靶mRNA互補結(jié)合，使靶mRNA降解或使靶mRNA翻譯終止，從而達到影響基因正常表達，使細胞、機體出現(xiàn)不同的臨床表現(xiàn)，從而發(fā)揮功能。研究表明，對于大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的miRNA，單個miRNA往往可以與幾十個靶mRNA相結(jié)合，而很多mRNA往往又能與多個miRNA結(jié)合，受多個miRNA的干擾。因此，miRNA的作用網(wǎng)絡(luò)是十分巨大的。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)miRNA的生物學作用受自身基因多態(tài)性的調(diào)節(jié)。當一個基因多

3、態(tài)位點位于pri-miRNA或pre-miRNA上時，可通過影響Drosha或Dicer酶的作用從而影響成熟miRNA的表達量。當一個基因多態(tài)位點位于miRNA的5'種子區(qū)域時，可通過影響miRNA與靶mRNA的結(jié)合能力影響miRNA的功能發(fā)揮。研究表明，miRNA的差異表達譜可在很多腫瘤組織中觀察到，且miRNA的高表達或低表達常伴有增高的腫瘤危險度或較差的預(yù)后。位于miRNA關(guān)鍵位點的基因多態(tài)性也可提示腫瘤的危險度和預(yù)后的好壞。關(guān)于

4、miRNA基因多態(tài)性與肺癌預(yù)后的關(guān)系研究得還不夠深入、透徹。因此，本研究擬通過研究miRNA單核苷酸多態(tài)性與非小細胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系來研究miRNA在腫瘤中的作用，并通過構(gòu)建體外細胞模型來研究miRNA單核苷酸多態(tài)性在肺癌細胞中發(fā)揮作用的機制，以期對miRNA在肺癌的作用機制有一個更加完善的了解，并為肺癌的治療提供更加精確的方案，提高治療效果，延長患者壽命和生命質(zhì)量。
　　研究方法:本文綜合meta分析結(jié)果和生物信息學分析結(jié)果，

5、篩選擬研究的miRNA的基因多態(tài)位點，構(gòu)建隊列研究多態(tài)位點與非小細胞肺癌NSCLC預(yù)后的關(guān)系，并通過功能學實驗驗證多態(tài)位點的功能以及可能的靶基因。
　　1、meta分析的材料和方法
　　使用SCIE、PubMed、CBM、CNKI、萬方、Google學術(shù)搜索、引文索引、參考文獻列表索引等在線數(shù)據(jù)庫或資源，進行按關(guān)鍵詞或主題詞進行同義詞、近義詞擴展檢索，根據(jù)各種排列組合綜合檢索得到所有可能的文獻。通過標題、摘要等的閱讀納入可能

6、相關(guān)的文獻，排除重復發(fā)表的文獻，提取數(shù)據(jù)，使用STATA13.0軟件進行meta分析計算合并后的HR和95％CI，確定是否存在異質(zhì)性，并進行相應(yīng)的發(fā)表偏倚分析和敏感性分析，以確定研究的質(zhì)量。
　　2、隊列研究的材料和方法
　　通過dbSNP、miRBase、Patrocles、HapMap、viennaRNA等數(shù)據(jù)庫和軟件篩選擬研究的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，建立隊列進行驗證。隊列研究得到中國醫(yī)科大學倫理委員會的審批通過

7、，并與每一位患者簽定了知情同意書。調(diào)查前，制定納入、排除標準，進行隊列的構(gòu)建，納入的所有研究對象經(jīng)過病理類型的確認，所有調(diào)查人員進行流行病學調(diào)查培訓，收集患者的年齡等基線資料和病理類型等臨床信息，同時采集患者靜脈血，提取DNA，進行基因分型。并對每一個患者進行電話隨訪，每三個月進行電話隨訪一次，直到患者死亡、失訪或隊列隨訪結(jié)束。通過沈陽市CDC、沈陽市公安局、患者病志確定患者死因和死亡日期。收集60例患者的肺癌組織，提取總RNA，使用2

8、-△△CT法計算不同基因型患者成熟體miRNA的相對表達量，計算不同基因型患者的中位生存時間(MST)，使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖，并用log-rank法檢驗生存時間的差異是否有統(tǒng)計學意義。采用單因素和多因素的COX比例風險回歸模型計算粗HR及其95％CI和調(diào)整后的HR及其95％CI，計算基因多態(tài)性與預(yù)后的關(guān)聯(lián)強度。
　　3、功能學研究的材料和方法
　　構(gòu)建含miR-149野生等位基因的過表達載體、含miR

9、-149 rs2292832突變等位基因的過表達載體，慢病毒包裝質(zhì)粒，穩(wěn)轉(zhuǎn)入人非小細胞肺癌A549細胞系，得到穩(wěn)定表達細胞株，使用CCK-8法檢測細胞的增殖能力，使用細胞周期檢測試劑盒檢測細胞周期的變化，使用CCK-8法檢測經(jīng)DDP處理的細胞增殖能力，從而判斷細胞的藥物敏感性。使用Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫篩選得到miR-149的靶位點TOP1，使用String軟件進行DNA拓撲異構(gòu)酶1(TOP1)基因的GO分析和KEGG分析，構(gòu)

10、建含TOP13' UTR區(qū)的雙熒光素酶報告系統(tǒng)判斷miR-149與TOP1的靶向作用，使用qRT-PCR法檢測miR-149和TOP1基因的mRNA表達水平，使用western blot進行TOP1蛋白表達量的檢測。
　　結(jié)果:
　　1、meta分析結(jié)果
　　(1) miR-146a rs2910164與腫瘤預(yù)后的關(guān)系
　　本研究發(fā)現(xiàn)GG基因型與腫瘤總生存率(OS)的關(guān)系主要存在于美國人群里。我們未觀察到miR-

11、146a的單核苷酸多態(tài)性SNP與全腫瘤的無病生存率DFS、無復發(fā)生存率RFS的關(guān)系。未發(fā)現(xiàn)miR-146a基因多態(tài)性與非小細胞肺癌和消化系統(tǒng)腫瘤預(yù)后的關(guān)系。
　　(2) miR-196a2 rs11614913與腫瘤預(yù)后的關(guān)系
　　本研究發(fā)現(xiàn)含C基因型與腫瘤預(yù)后有關(guān)，且提示預(yù)后較差，經(jīng)分層分析結(jié)果顯示，這種關(guān)系存在于亞洲人群、消化系統(tǒng)、非小細胞肺癌中。而且攜帶有C的基因型與全腫瘤的RFS有關(guān)。未觀察到與DFS的關(guān)系。

12、　　(3) miR-149 rs2292832與腫瘤預(yù)后的關(guān)系
　　本研究發(fā)現(xiàn)C等位基因與全腫瘤OS有關(guān)，且提示預(yù)后良好，隨著C等位基因數(shù)量的增多效應(yīng)增強。經(jīng)分層分析發(fā)現(xiàn)，C等位基因與非小細胞肺癌OS有關(guān)，卻與消化系統(tǒng)OS無關(guān)。
　　(4) miR-499 rs3746444與腫瘤預(yù)后的關(guān)系
　　本研究在顯性模型中觀察到miR-499基因多態(tài)性與腫瘤預(yù)后的關(guān)系，但未在亞洲人群、消化系統(tǒng)腫瘤和非小細胞肺癌中觀察到miR-

13、499基因多態(tài)性與腫瘤預(yù)后的關(guān)系。
　　(5)發(fā)表偏倚檢驗和敏感性分析
　　經(jīng)漏斗圖和Begg檢驗，未觀察到研究存在發(fā)表偏倚。經(jīng)敏感性分析，發(fā)現(xiàn)研究結(jié)果穩(wěn)定可靠。
　　2、隊列研究結(jié)果
　　(1)5個SNP位點與OS的關(guān)系
　　miR-149 rs2292832的含C基因型與預(yù)后有關(guān)，且提示預(yù)后較好，含有C基因型的患者MST更長，死亡率較低。未觀察到miR-146a rs2910164、miR-196a2r

14、s11614913、miR-423 rs6505162、miR-608 rs4919510與NSCLC預(yù)后的關(guān)系。
　　(2)5個SNP位點與OS關(guān)系的分層分析
　　分層分析結(jié)果顯示，在多個亞組中miR-149基因多態(tài)性與OS的關(guān)系具有統(tǒng)計學意義。在鱗癌患者中觀察到miR-196a2基因多態(tài)性與肺癌預(yù)后有關(guān)，含C基因型提示肺癌預(yù)后較好。在接受化療和手術(shù)的患者中觀察到miR-608基因多態(tài)性與肺癌預(yù)后有關(guān)，且含C基因型提示預(yù)后

15、較差。分層分析未觀察到miR-146a和miR-423基因多態(tài)性與肺癌預(yù)后的關(guān)系。
　　(3)聯(lián)合作用結(jié)果
　　miR-149和miR-196a2在鱗癌患者中存在聯(lián)合效應(yīng)，隨著miR-149和miR-196a2的C等位基因個數(shù)的增加效應(yīng)增強。miR-149的含C基因型和miR-608的含G基因型的基因的聯(lián)合作用存在于接受化療和手術(shù)的患者中。
　　(4)5個SNP與肺癌組織中成熟miRNA表達量的關(guān)系
　　miR-

16、149含C基因型、miR-146a含G基因型、miR-196含C基因型可增加成熟miRNA的表達量，miR-423和miR-608的基因多態(tài)位點與相應(yīng)成熟miRNA的表達量無關(guān)。
　　(5) miR-27a和miR-30c-1基因多態(tài)性與肺癌預(yù)后的關(guān)系
　　miR-30c-1的含G基因型，miR-27a的含C基因型是肺癌預(yù)后的獨立影響因素，且提示預(yù)后較差，經(jīng)分層分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在多個亞組中兩者與肺癌預(yù)后的關(guān)系具有統(tǒng)計學意義，且

17、兩者具有聯(lián)合作用，含突變等位基因數(shù)量越多，患者預(yù)后越差。
　　3、功能研究結(jié)果
　　(1) miR-149 rs2292832與A549細胞成熟miRNA表達量的關(guān)系
　　含C等位基因的細胞miR-149的表達量約是含T等位基因的細胞miR-149的表達量的1.55倍。
　　(2) miR-149 rs2292832與細胞增殖和細胞周期的關(guān)系
　　含C等位基因的細胞增殖能力弱于含T等位基因的細胞。含C等位基

18、因的細胞其細胞周期與含T等位基因的細胞其細胞周期比較，存在G1/S阻滯。
　　(3)雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測結(jié)果
　　導入TOP1-3' UTR區(qū)和miR-149短片段的細胞其相對熒光素酶活性要低于其他三個對照組，即導入TOP1-3' UTR區(qū)和NC mimics組，導入TOP1-3' UTR突變體和miR-149 mimics組，導入TOP1-3' UTR區(qū)突變體和NC mimics組。
　　(4) miR-149 r

19、s2292832位點與TOP1基因表達的關(guān)系
　　miR-149基因多態(tài)性與TOP1基因的mRNA表達量無關(guān)，但與TOP1蛋白表達量水平有關(guān)。含C等位基因的細胞TOP1蛋白表達量低于含T等位基因的細胞。
　　(5) miR-149 rs2292832位點對順鉑處理敏感的影響
　　含C等位基因的細胞比含T等位基因細胞對0.977ug/ml，62.5ug/ml，125ug/ml，500ug/ml濃度的順鉑處理更敏感，而對3

20、.906ug/ml和250ug/ml濃度的順鉑處理較不敏感。
　　結(jié)論:miR-149、miR-196a2、miR-608、miR-27a和miR-30c-1基因多態(tài)性與肺癌預(yù)后有關(guān)，且miR-149、miR-27a和miR-30c-1是肺癌預(yù)后的獨立影響因素。 miR-149、miR-196a2的C等位基因具有聯(lián)合作用，可提示肺鱗癌患者的良好預(yù)后。miR-149的C等位基因與miR-608的G等位基因具有聯(lián)合作用，可提示接受化療