1、本研究利用β-葡萄糖苷酶的活性篩選策略,對(duì)課題組前期構(gòu)建的堿性污染土壤樣品的宏基因組文庫AL01進(jìn)行篩選,得到了一個(gè)表達(dá)β-葡萄糖苷酶活性的陽性克隆pGXAG805。對(duì)其進(jìn)一步亞克隆和序列分析,獲得兩個(gè)可能編碼新型β-葡萄糖苷酶的基因的開放閱讀框,分別命名為:bgl1D(Genbank登錄號(hào)為FJ686869)和bgl1E(Genbank登錄號(hào)為FJ686868)。
　　 生物信息學(xué)分析表明:bgl1D基因由519個(gè)堿基對(duì)組成,

2、bgl1E基因由456個(gè)堿基對(duì)組成。在核苷酸水平上,bgl1D、bgl1E與已知數(shù)據(jù)庫中的β-葡萄糖苷酶基因沒有任何相似性。在氨基酸水平上,Bgl1D與其他糖基水解酶蛋白的相似性很低,與來源于弗蘭克氏細(xì)菌的糖基水解酶家族3的蛋白有25％的相似性;Bgl1E和來自嗜熱網(wǎng)球菌的一種屬于糖基水解酶蛋白質(zhì)家族4的水解酶有41％的相似性,和來自Flavobacterium johnsoniae UW101的一種扁桃體消旋酶蛋白有29％的相似性,和

3、來自嗜熱網(wǎng)球菌的一種6-磷酸式-β-葡萄糖苷酶有39％的相似性。
　　 將PCR擴(kuò)增得到的目標(biāo)ORF與載體pETBlue-2連接,轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),得到重組菌株pGXAG801、pGXAG803,在含有檸檬酸鐵銨和七葉苷的LA平板上均能表現(xiàn)出β-葡萄糖苷酶活性。
　　 編碼產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化后,以pNPGlu為底物,對(duì)其進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的初步研究,得到以下結(jié)論。Bgl1D的最適pH為10.0;最適溫度為30℃

4、;Km可能為0.54 mmol/L;Vmax可能為2.01μmol/min;最適條件下酶活可能為4.91 U/mg;Al3+、Li+、Cu2+、Co2+、Cr3+離子對(duì)酶反應(yīng)有激活作用,Zn2+、Ba2+、Fe3+離子有抑制作用;高濃度葡萄糖對(duì)酶活有抑制作用,抑制常數(shù)可能為62.2 mM;半衰期可能6 h。Bgl1E的最適pH為10.0;最適溫度為25℃:Km可能為2.12 mmol/L;Vmax可能為4.17μmol/min;最適條件