1、能量代謝重編碼是腫瘤的第九大特征，限制葡萄糖供應(yīng)的饑餓療法可能是一種安全、有效的治療方法。然而，葡萄糖饑餓對肝癌細胞惡性表型的影響及相關(guān)分子機制目前仍不清楚。本研究采用低糖(LG)和對照高糖(Control)培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌細胞，通過Transwell遷移實驗和劃痕實驗檢測低糖對肝癌細胞遷移能力的影響;再用shRNA干擾HSF1以及HSF l-shRES基因回補策略，分析HSF1在LG影響肝癌細胞遷移能力中的作用;最后通過生物信息學(xué)分析、

2、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(CHIP)以及熒光素酶報道基因活性測定進一步探討相關(guān)的分子機制，為肝癌治療提供新的策略。
　　第一部分低糖對肝癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及遷移能力的影響
　　TGF-β1是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的有力誘導(dǎo)劑，經(jīng)5ng/mL TGF-β1處理肝癌細胞48h后，Control組肝癌細胞出現(xiàn)典型EMT樣形態(tài)學(xué)變化，細胞由多邊形向成纖維樣細胞形態(tài)改變，而LG組無顯著變化。熒光定量PCR和蛋白印跡方法檢測EMT相

3、關(guān)的標(biāo)志物表達情況，Transwell遷移實驗和劃痕實驗測定細胞遷移能力的改變。結(jié)果顯示，培養(yǎng)細胞48h后，LG組N-cadherin的表達水平較Control組明顯降低，而E-cadherin的表達水平較Control組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)細胞30h后LG組穿膜的細胞數(shù)較Control組明顯減少，差異有顯著性。劃痕實驗顯示與Control組相比LG組劃痕的愈合速度明顯減慢，且LG組劃痕邊

4、緣的細胞呈上皮細胞樣，而Control組劃痕邊緣的細胞呈成纖維細胞樣。本部分研究表明LG抑制肝癌細胞的EMT樣形態(tài)學(xué)改變，抑制其“鈣黏著蛋白轉(zhuǎn)換”及遷移能力。
　　第二部分 HSF1在低糖抑制肝癌細胞EMT及遷移能力中的作用
　　HSF1是一個具有促癌作用的多功能轉(zhuǎn)錄因子，參與腫瘤細胞的葡萄糖代謝，并促進惡性表型和轉(zhuǎn)移。熒光定量PCR和蛋白印跡顯示LG培養(yǎng)持續(xù)下調(diào)HSF1的表達，推測HSF1可能參與葡萄糖饑餓對肝癌細胞惡性表

5、型的影響。為了確認(rèn)HSF1是否在低糖條件下肝癌細胞EMT及相關(guān)遷移中發(fā)揮作用，構(gòu)建了shHSF1、對照shNT以及HSF1基因回補（shRES），并采用熒光定量PCR和蛋白印跡加以驗證。熒光定量PCR和蛋白印跡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染shHSF1之后，HSF1表達水平顯著降低，說明HSF1基因干擾可信;shRES組HSF1表達水平較shHSF1組回升，說明HSF1基因回補策略可抵消干擾作用。此外，通過Transwell和劃痕實驗觀察細胞處理前后肝

6、癌細胞遷移能力的改變。Transwell試驗結(jié)果顯示，與高糖培養(yǎng)相比，低糖培養(yǎng)時Control組和shNT組穿膜的細胞數(shù)明顯減少。然而，LG培養(yǎng)條件下，shHSF1組穿膜的細胞數(shù)較Control組和shNT組顯著增加。劃痕實驗結(jié)果與Transwell一致，LG培養(yǎng)條件下，shHSF1組劃痕的愈合速度明顯快于Control和shNT組。本部分研究結(jié)果表明，HSF1促進低糖對肝癌細胞EMT及遷移能力的抑制作用。
　　第三部分 HSF1

7、在低糖抑制肝癌細胞EMT及遷移能力中的作用機制
　　Snail是EMT過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。通過TRED數(shù)據(jù)庫和啟動子預(yù)測服務(wù)器2.0組合，發(fā)現(xiàn)Snail基因的啟動子序列位于上游的-700bp～299bp。此外，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(Transcription Factors Database)對人Snail基因全長序列進行分析，發(fā)現(xiàn)Snail啟動子區(qū)域存在熱休克元件(HSE)核心序列5'-nGAAn-3'結(jié)合位點。提示Snail可

8、能是HSF1下游的靶標(biāo)分子，HSF1可能通過直接調(diào)控Snail的轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)節(jié)Snail的表達。通過染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(CHIP)和熒光素酶報道基因活性測定加以驗證，結(jié)果顯示:與Control組相比，LG組的相對熒光素酶活性明顯增強，而且LG組特異性HSF1抗體結(jié)合的DNA產(chǎn)物量明顯高于Control組，差異具有顯著性。結(jié)果表明LG培養(yǎng)條件下HSF1能與Snail啟動子結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)其表達;而Control培養(yǎng)下HSF1與Snai