1、目的:細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)作為可以轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并激活轉(zhuǎn)錄因子的蛋白激酶，是眾多信號通路的“瓶頸”和匯集點(diǎn)。近年來發(fā)現(xiàn)抑制ERK信號通路，從而抑制HSCs活化與增殖，是目前治療肝纖維化比較理想的選擇。本實(shí)驗(yàn)通過檢測山芝麻酸甲酯(methyl helicterate，MH)對ERK信號通路上游靶位Raf、ERK1/2的表達(dá)及其磷酸化水平的影響和對轉(zhuǎn)錄因子c-

2、fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達(dá)的影響，探討其體外抗肝纖維化的分子機(jī)制。
　　方法:HSC-T6、LX2和7702選為本實(shí)驗(yàn)采用的肝星狀細(xì)胞，體外培養(yǎng)。用不同濃度MH作用于細(xì)胞，CCK-8試劑盒法檢測MH對細(xì)胞的毒性作用;10 ng/mL PDGF-BB，50μM PD98059及MH作用于細(xì)胞后，CCK-8試劑盒法、LDH法、劃痕實(shí)驗(yàn)、集落生成法、AO-EB染色和AnnexinⅤ-FITC/PI分別觀察細(xì)胞增殖、L

3、DH活力、遷移、集落形成、凋亡及細(xì)胞周期;RT-PCR法觀察ERK1、ERK2、Raf、c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1 mRNA的表達(dá);Western bolt免疫印跡法觀察細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2和Raf、p-Raf的表達(dá)。免疫組化法觀察細(xì)胞c-fos、c-jun、c-myc、Ets-1和Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)、Col-Ⅲ的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1) MH對PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、LDH活性、

4、遷移、集落形成、凋亡及細(xì)胞周期的影響
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源性刺激因子PDGF-BB刺激的模型組與正常對照組比較，細(xì)胞在24 h處增殖明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;12.5、25、50μg/mL的MH作用組與刺激組比較均能抑制細(xì)胞增殖，呈濃度依賴性(P＜0.05或P＜0.01)。與正常組比較，PDGF-BB刺激組細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)、LDH活性明顯減弱(P＜0.01)，細(xì)胞遷移及集落生成分別加快、增多，細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期均無明

5、顯改變;經(jīng)藥物干預(yù)后，PD98059和MHL、MHM、MHH能明顯抑制細(xì)胞增殖、遷移及集落的生成，提高LDH活性，此外，還引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化，提高細(xì)胞的凋亡率，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G2期(P＜0.05或P＜0.01)。以上結(jié)果表明，MH能明顯抑制肝星狀細(xì)胞的增殖、遷移及集落的生成，并促進(jìn)其凋亡。因而，證實(shí)了MH抗肝纖維化的調(diào)控機(jī)制與抑制肝星狀細(xì)胞的增殖有關(guān)，為其靶向防御肝纖維化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。
　　(2) MH對PDGF誘

6、導(dǎo)的細(xì)胞Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表達(dá)的影響
　　免疫組化結(jié)果顯示，與正常組比較，PDGF刺激組細(xì)胞Col-Ⅲ合成和分泌明顯增多，Col-Ⅰ含量升高。經(jīng)藥物干預(yù)后，PD98059和MHL、MHM、MHH能顯著抑制Col-Ⅲ的合成和分泌，降低Col-Ⅰ含量。結(jié)果提示，MH抗肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與其抑制肝星狀細(xì)胞膠原的合成與沉積密切相關(guān)。
　　(3)MH對PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞信號通路上游靶位Raf以及ERK1/2的表達(dá)及其磷酸化水平的影

7、響
　　實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PDGF可顯著上調(diào)肝星狀細(xì)胞Raf以及ERK1/2 mRNA的表達(dá)(P＜0.01)。Western Blot結(jié)果顯示，PDGF刺激組細(xì)胞Raf、p-Raf以及ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯增（P＜0.01）。經(jīng)藥物干預(yù)后，PD98059與MH均能顯著下調(diào)細(xì)胞Raf、ERK1/2 mRNA和Raf、p-Raf及ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01)。

8、可見，MH能顯著抑制肝星狀細(xì)胞Raf及ERK1/2的表達(dá)和磷酸化水平，降低上游靶位ERK的活性，對ERK信號通路有明顯的抑制作用。
　　(4)MH對PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達(dá)的影響
　　實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PDGF刺激組細(xì)胞c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1 mRNA表達(dá)明顯高于正常組(P＜0.01)。經(jīng)藥物干預(yù)后，PD98059與MH均能顯著下調(diào)細(xì)胞

9、c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1 mRNA水(P＜0.05或P＜0.01)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，顯示細(xì)胞質(zhì)內(nèi)c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1陽性染色細(xì)胞增多濃染。經(jīng)藥物干預(yù)后，PD98059與MH細(xì)胞質(zhì)內(nèi)c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1陽性染色細(xì)胞數(shù)減少淡染。這表明，MH能抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達(dá)，其能抑制ERK活化，阻滯了ERK通路信號傳導(dǎo)。