1、骨組織工程作為一種新型且高效的骨組織缺損的修復(fù)方法，近年來(lái)逐漸受到人們的廣泛關(guān)注。骨組織工程修復(fù)策略的關(guān)鍵步驟之一，就是制備出無(wú)毒、可代謝、生物相容性好、具有骨誘導(dǎo)性且具有適宜機(jī)械強(qiáng)度的組織工程支架。幾乎沒(méi)有一種單一材料能夠同時(shí)滿足以上所有要求，因此需要將不同種類(lèi)，不同性質(zhì)的材料進(jìn)行復(fù)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短以滿足骨修復(fù)和骨重建的需要。聚乳酸(Polylactic acid，PLA)是一種無(wú)毒可代謝的高分子材料，機(jī)械強(qiáng)度較高且具有很好的可塑性。羥基

2、磷灰石(Hydroxyapatite，HAp)是天然骨的主要成分之一，具有良好的生物相容性，能夠誘導(dǎo)新骨的發(fā)生且具有較好的骨傳導(dǎo)性。脫細(xì)胞羊膜(Human acellular amniotic membrane，HAAM)是脫細(xì)胞材料的代表之一，具有優(yōu)越的生物相容性，主要成分是富含膠原和粘多糖，具有天然三維結(jié)構(gòu)，無(wú)致免疫性?；诖?，本文首先制備脫細(xì)胞羊膜，并對(duì)脫細(xì)胞羊膜的理化性質(zhì)和生物相容性進(jìn)行了表征；繼而制備了PLA+nHAp+HAA

3、M復(fù)合支架，并對(duì)該復(fù)合支架的孔隙率、吸水率、彈性模量等進(jìn)行表征，之后使用成骨細(xì)胞(Osteoblasts)構(gòu)建了細(xì)胞-支架復(fù)合物，對(duì)復(fù)合物的各項(xiàng)生物學(xué)性能進(jìn)行表征。
　　HAAM的制備：新鮮胎盤(pán)獲取自大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，經(jīng)過(guò)產(chǎn)婦知情和同意。利用鈍性剝離法可以從胎盤(pán)上完整地獲取新鮮羊膜，宏觀觀察發(fā)現(xiàn)新鮮羊膜是一層淡白色薄膜，具有較高的彈性和吸水性。顯微觀察后發(fā)現(xiàn)，羊膜上皮細(xì)胞呈鋪路石狀，均勻緊密地分布在羊膜表面。實(shí)驗(yàn)通過(guò)四種方

4、法分別制備了HAAM：①1%TritonX-100溶液+0.25%胰酶/EDTA溶液、②5%TritonX-100溶液+0.25%胰酶/EDTA溶液、③0.5mol/L氫氧化鈉刮擦、④3mol/L高滲鹽水+0.25%胰酶/EDTA溶液。通過(guò)檢測(cè)最終將高滲鹽水+0.25%胰酶/EDTA溶液選作最優(yōu)的HAAM制備法。對(duì)最優(yōu)制備的HAAM進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HAAM中含有大量的純度較高的膠原且保持了完整的螺旋結(jié)構(gòu)和官能基團(tuán)。對(duì)HAAM的生物

5、相容性進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞間突觸相連形成細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，說(shuō)明接種在HAAM上的細(xì)胞保持了良好的增殖活性和形態(tài)特征。此外，通過(guò)MTT法檢測(cè)了細(xì)胞活率，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖速度較快，在第4天細(xì)胞數(shù)目達(dá)到頂峰，說(shuō)明了本文中制備的HAAM具有良好的生物相容性，能夠用于骨組織工程支架的制備。
　　復(fù)合支架制備：本文制備的復(fù)合支架具有大孔包小孔的復(fù)合孔結(jié)構(gòu)，大孔直徑為200μm，能夠?yàn)榧?xì)胞提供足夠的增殖空間并適宜于實(shí)體骨組織的生成和發(fā)育，小孔

6、直徑為30μm。通過(guò)正交試驗(yàn)確定PLA濃度為6%、HAAM濃度為2%、nHAp濃度為3%為最佳制備條件。純PLA與水的接觸角為100±2.0°，吸水率為98.6±1.5%，加入nHAp之后材料接觸角降為75.7±5.1°，吸水率升高至118.5±4.9%，進(jìn)一步加入HAAM之后復(fù)合材料的接觸角降為38.7±2.5°，吸水率達(dá)到249.7±8.9%。對(duì)復(fù)合支架進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)后分別發(fā)現(xiàn)了三種材料的特征峰，證實(shí)這三種材料的成功復(fù)合并保持了結(jié)

7、構(gòu)的完整性。通過(guò)負(fù)荷-位移曲線測(cè)算得材料的彈性模量，發(fā)現(xiàn)nHAp的加入均能夠提升材料機(jī)械強(qiáng)度，但HAAM的加入會(huì)在一定程度上降低材料的機(jī)械強(qiáng)度。降解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PLA+nHAp+HAAM組的支架降解速率最快，在第12周降解率達(dá)到39.48±0.93%，顯著高于純PLA組的34.59±0.32%。純PLA支架在12周的降解環(huán)境pH為4.74±0.057，加入nHAp和HAAM之后升至6.12±0.021，顯著改善了環(huán)境酸化問(wèn)題。
　　

8、成骨細(xì)胞-支架復(fù)合物的體外構(gòu)建：從SD大鼠新生鼠顱蓋骨中提取的成骨細(xì)胞形態(tài)良好，具有較好的增殖能力，堿性磷酸酶染色后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞基質(zhì)中有大量灰黑色顯色物質(zhì)，茜素紅染色后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周?chē)嬖诖罅考t色礦化結(jié)節(jié)，說(shuō)明了成骨細(xì)胞良好的體外成骨能力。對(duì)細(xì)胞-支架進(jìn)行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞在支架上貼壁良好，細(xì)胞間存在突出連接。熒光染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在復(fù)合支架上分布均勻，細(xì)胞大量存活且具有良好的活性，其中細(xì)胞在PLA+nHAp+HAAM組支架上的活性要高于

9、PLA+nHAp組和純PLA組。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HAAM和nHAp的復(fù)合支架上的細(xì)胞數(shù)量均要顯著高于純PLA組。ALP定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在3周內(nèi)成骨細(xì)胞在各組支架上分泌的ALP持續(xù)增加，且HAAM和nHAp的加入均能明顯促進(jìn)ALP的分泌。測(cè)定4h細(xì)胞黏附率發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在HAAM上的黏附率最高，且加入nHAp和HAAM之后均能夠促進(jìn)細(xì)胞在支架上的快速黏附。結(jié)果表明，HAAM具有良好的理化性能和生物相容性，本研究制備的PLA+nHAp+HAAM復(fù)