1、肝素(heparin，HP)類藥物作為抗凝血和血栓治療藥物應用于臨床已經(jīng)有50余年的歷史，市場需求不斷增長。目前，HP類藥物原料的生產依然依靠動物組織提取，來源有限而且質量不穩(wěn)定。建立安全高效的體外合成HP類化合物的方法代替現(xiàn)有原料生產方式，一直是研究人員努力的方向。經(jīng)過10余年的努力，酶法合成具有生物活性的HP寡糖的研究取得了突破性進展，但現(xiàn)有技術體系中存在著各種瓶頸問題，制約著HP類藥物的規(guī)?；苽?。比如，N位點硫酸化葡糖胺（N-s

2、ulfated glucosamine，GlcNS）直接定位合成困難和催化骨架合成的糖基轉移酶（glycosyltransferases，GTs）活性快速分析方法缺失是現(xiàn)有酶法合成技術體系中亟待解決的兩個問題。針對上述兩個問題，本論文以提高HP寡糖酶法合成技術體系的效率和規(guī)?；瘧脻摿槟康?，完成了兩部分工作:通過結構均一確定模式底物，揭示了人源硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)N-脫乙?；?N-硫酸基轉移酶4（N-

3、Deacetylase/N-sulfotrans ferase4，NDST4）的催化模式;建立了偶聯(lián)釀酒酵母尿苷二磷酸(uridine diphosphate，UDP)水解酶（yeast nucleoside diphosphatase，YND1）的GT反應高通量篩選體系。
　　1.硫酸乙酰肝素NDST4催化模式的研究
　　N-脫乙?；?N-硫酸基轉移酶（N-deacetylase/N-sulfotransferase，N

4、DST）是HS生物合成途徑中糖鏈骨架合成完成后的第一個硫酸化修飾酶，其催化獲得的N位點硫酸化的葡糖胺是后續(xù)一系列硫酸基轉移酶和葡萄糖醛酸異構酶底物識別的結構基礎。HS糖鏈中硫酸根基團的排列形式?jīng)Q定了其與蛋白因子的結合能力，進而影響含有該糖鏈的蛋白聚糖的生物活性。因此，系統(tǒng)的研究NDST的底物特異性等催化機制不但對揭示HS生物合成控制機理具有重要的理論價值，而且相關結論可以直接指導HP寡糖的體外酶法合成。
　　人體細胞內存在4種具有

5、不同的底物特異性NDST同工酶，共同調節(jié)HS的N位點硫酸化修飾。伴隨著結構均一確定的HS寡糖酶法合成體系的建立，NDST1的催化模式已被充分闡明。但NDST其他3種同工酶的催化模式還未被充分研究。論文利用由昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)(baculovirus expression system)表達的重組NDST4與一系列化學結構確定的模式底物，在體外模擬HS生物合成過程中N位點硫酸化修飾過程，通過解析反應產物的結構，揭示了NDST4的催化機制。論

6、文研究結果表明:(1)單獨的重組NDST4不具有N-脫乙?；富钚?(2)NDST4具有較強的N-硫酸基轉移酶活性;(3)與NDST1隨機結合底物糖鏈中的GlcNAc位點，定向催化的模式不同，NDST4的N-硫酸基轉移酶活性沒有表現(xiàn)出方向性?；谝陨辖Y論，該同工酶在HS糖鏈的體內生物合成中不是調控糖鏈高硫酸化區(qū)域(NS domain)和低硫酸化區(qū)域(NAc domain)相間排列的關鍵酶;應用方面，NDST4具備成為轉化葡糖胺(gluc

7、osamine，GlcN)為N位點硫酸化葡糖胺（N-sulfated glucosamine，GlcNS）工具酶的潛力。
　　2.偶聯(lián)釀酒酵母UDP水解酶的Leloir-GT活性高通量篩選方法的建立
　　GT是生物體內負責催化糖苷鍵合成酶類，它不但是糖生物學研究重點之一，而且是糖生物工程重要的工具酶分子之一，廣泛用于體外糖鏈及糖綴復合物的酶法制各。絕大多數(shù)GT需要以核苷活化的單糖為給體，被稱為Leloir-GT。但嚴格的底物

8、特異性限制了天然GT酶分子合成能力，產生了“糖鏈及其復合物的應用價值”與“酶法合成能力缺陷”的矛盾。以酶法合成HP寡糖技術體系為例，骨架合成工具酶分子巴斯德氏菌（Pasteurella multocida）肝素前體聚合酶2(pmHS2)嚴格的單糖供體選擇性是制約現(xiàn)有體系效率的瓶頸之一。利用蛋白質工程改造該GT的底物選擇性是突破艾杜糖醛酸(iduronic acid，IdoA)轉化這一瓶頸問題的有效手段。定向進化的成功在很大程度上依賴于針

9、對GT活性的高通量篩選方法的建立。當前大多數(shù)Leloir-GTs活性測定方法基于質譜和色譜分離方法等復雜儀器或方法，不滿足pmHS2分子定向進化的要求。
　　針對以上問題，論文在可溶性重組表達釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）高爾基體膜蛋白UDP水解酶(YND1)的基礎上，建立了一種Leloir-GT活性高通量篩選方法。我們通過將YND1對UDP的水解反應、Leloir-GT反應和PO32-的磷鉬藍顯色反

10、應偶聯(lián)起來建立了一個簡便、靈敏、快速的高通量篩選體系，并用GAG骨架合成中最重要的3種GTs共同驗證了該體系的有效性和普適性。具體研究內容包括:(1)通過將YND1(GeneID:856722)第1504-1554位的疏水性跨膜區(qū)用3組甘氨酸-絲氨酸重復堿基(502F-518H/GSGSGS)進行替換的方法，實現(xiàn)了釀酒酵母跨膜蛋白YND1以可溶且有活性的狀態(tài)在大腸桿菌中表達;(2)重組YND1的酶學性質研究表明其最佳反應條件與大多數(shù)Le

11、loir-GT的理想反應條件一致，表明重組YND1催化的核苷酸水解反應可以實現(xiàn)與GT催化的糖基轉移反應相偶聯(lián);(3)將GT反應與重組表達的YND1偶聯(lián)，優(yōu)化了反應與分析條件，建立了一種建立了一種快速、簡便、準確性高的GT活性檢測方法;以糖胺聚糖骨架合成中重要的糖基轉移酶KfiA、pmHS2和KfoC為Leloir-GTs的模式工具酶分子，確定了該方法的有效性;(4)借助YND1偶聯(lián)GT反應消除反應副產物UDP潛在抑制作用，可以明顯促進G