1、目的：
　　植入前綜合征（PES）是一種高發(fā)于非血緣臍血移植（UCBT）后在中性粒細胞植入之前，以發(fā)熱、皮疹、腹瀉等為主要臨床表現(xiàn)的一種免疫反應(yīng)。發(fā)生重癥PES的患者，移植相關(guān)死亡率明顯增高。本研究通過對UCBT后發(fā)生PES患者外周血進行供受者基因嵌合狀態(tài)檢測，了解發(fā)生PES時細胞的來源；根據(jù)血清細胞因子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)可溶性ST2（sST2）在PES發(fā)生時明顯升高，選擇新鮮臍血和外周血干細胞，采用IL-33和sST2進行體外刺激，探

2、索發(fā)生PES的效應(yīng)細胞，為PES發(fā)病機制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　本研究分為兩部分。
　　第一部分：UCBT后發(fā)生PES的細胞來源的研究。根據(jù)本中心先前的研究發(fā)現(xiàn)UCBT后PES發(fā)生的中位時間為UCBT后第7天（+7d），選擇移植患者+7d的外周血標本，采用短串聯(lián)重復(fù)序列聚合酶鏈式反應(yīng)（STR-PCR）技術(shù)檢測發(fā)生PES組和未發(fā)生PES組患者供受者嵌合狀態(tài)，分析發(fā)生PES的細胞來源。
　　第二部分：UCB

3、T后發(fā)生PES的效應(yīng)細胞的探討。一、UCBT后PES發(fā)生時各種免疫細胞及其亞群和相關(guān)細胞因子的檢測。檢測PES發(fā)生時的T、B、NK和單核細胞及其亞群的變化；檢測患者移植前、移植當(dāng)天、PES發(fā)生時不同時間點的外周血的白細胞數(shù)，血漿C-反應(yīng)蛋白和血清中相關(guān)細胞因子的變化。二、不同來源的移植物體外刺激實驗：sST2在PES發(fā)生時顯著增高，而ST2是IL-33的孤兒受體，擬從IL-33/ST2信號通路來推證PES的效應(yīng)細胞。應(yīng)用 IL-33,s

4、ST2刺激新鮮臍血、外周血干細胞（動員采集的同胞供者），每種類型的細胞分4組：實驗組：A．IL-33+sST2組；對照組：B．sST2組；C．IL-33組；D．空白組。經(jīng)體外培養(yǎng)0、12、24和72小時后，細胞計數(shù)板計算刺激前后細胞總數(shù)，流式細胞術(shù)檢測刺激前后細胞亞群及ST2受體表達情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分 UCBT后發(fā)生PES的細胞來源的研究
　　STR-PCR檢測臍血及受者移植前后的標本比對供受者的嵌合狀態(tài)

5、，結(jié)果顯示：UCBT+7d供者的嵌合度發(fā)生PES組明顯高于未發(fā)生PES組，分別為70.58±22.86%與37.18±18.96%，兩組之間有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.0001。
　　第二部分 UCBT后發(fā)生PES的效應(yīng)細胞的探討
　　一、UCBT后發(fā)生PES時各種免疫細胞及其亞群和相關(guān)細胞因子的檢測
　　1.白細胞的變化PES組與無PES組在移植前、移植當(dāng)天、PES發(fā)生時的白細胞計數(shù)組間無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。<

6、br>　　2.PES發(fā)生時T、B、NK和單核細胞的細胞亞群檢測結(jié)果：CD45+CD3+T淋巴細胞、CD45+CD3-CD19+B淋巴細胞、CD45+CD3-CD56+NK細胞、CD45+CD3-CD14+單核細胞分別占90%，0.3%，2.1%和0.2%。PES組與無PES組的T、B、NK和單核細胞的各細胞亞群比例無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。
　　3.C-反應(yīng)蛋白的變化在移植前、移植當(dāng)天、PES發(fā)生時，PES組和無PES組兩組

7、之間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。
　　4.血清細胞因子的變化
　　發(fā)生PES時細胞因子IL-6、MCP-1和sST2在PES組明顯高于無PES組（P<0.05）；PES組自身比較患者發(fā)生PES時也顯著高于移植前、移植當(dāng)天的水平（P<0.05）。PES患者治療有效者細胞因子IL-6和MCP-1明顯下降并恢復(fù)至發(fā)生前水平（P<0.01），而sST2與PES發(fā)生時相比雖有所下降但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　發(fā)生P

8、ES時IFN-γ、IL-2、IL-1Rα、IL-4、IL-8、IL-17A、IL-33、MIP-1α、MIP-1β和TNF-α表達水平兩組相近無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），同時PES組患者在不同的時間點，自身對比其表達水平相近無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。
　　二、不同來源的移植物體外刺激實驗
　　1.細胞數(shù)量的變化：新鮮臍血和外周血干細胞經(jīng)IL-33、sST2刺激培養(yǎng)后，各組刺激前后細胞數(shù)量無明顯增加（P>0.05），兩種

9、來源不同的細胞刺激培養(yǎng)12h后均出現(xiàn)多形性變化，此后隨培養(yǎng)時間延長形態(tài)變化不顯著。
　　2.T、B、NK和單核細胞各亞群的變化：新鮮臍血經(jīng)Ficoll提取單個核細胞后，臍血提取的單個核細胞比例分別為T淋巴細胞30-50%、B淋巴細胞1-3%，NK細胞5-8%，單核細胞5-13%。外周血干細胞中T淋巴細胞20-35%、B淋巴細胞2-5%，NK細胞3-9%，單核細胞18-32%。經(jīng)刺激培養(yǎng)12、24和72h后，四組的T、B、NK和單核

10、細胞亞群比例無明顯差異（P>0.05），隨著培養(yǎng)時間的延長，有少量細胞凋亡，實驗各組細胞不同培養(yǎng)時間點的細胞亞群比例也無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。
　　3.T、B、NK和單核細胞ST2受體表達情況：新鮮臍血和外周血干細胞中ST2受體表達相似，單核細胞上ST2受體表達量高達53-90%，其次是B淋巴細胞亞群約為30-60%，T淋巴細胞及NK細胞亞群表達量低，分別為2-5%和3-10%。而四組的各細胞亞群ST2受體表達無明顯變化

11、（P>0.05），實驗各組細胞不同培養(yǎng)時間點的各細胞亞群ST2表達也無顯著變化（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.UCBT后PES是供者開始植入時引發(fā)多種細胞因子參與的免疫反應(yīng)，其效應(yīng)細胞推測來源于供者，供者的早期嵌合是PES發(fā)生的高危因素。
　　2.血清中單核細胞相關(guān)的趨化因子（MCP-1）在PES發(fā)生時明顯升高，而淋巴細胞相關(guān)的較特異的細胞因子（IL-2、IL-4、IL-8、IL-17A）在PES發(fā)生時無顯著變

12、化，PES的臨床表現(xiàn)主要在皮膚、腸道等組織中，推斷組織中的單核巨噬細胞可能是PES的主要效應(yīng)細胞。
　　3.加入IL-33和sST2進行單純的體外培養(yǎng)，未見到免疫細胞的增殖和ST2受體表達的增高，但不能確定細胞因子水平是否發(fā)生變化，需進一步檢測細胞培養(yǎng)液中細胞因子的變化，觀察IL-33/ST2信號通路及sST2是否對下游細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)存在影響，從而引起細胞因子的分泌。同時本實驗也需要加測各免疫細胞活化的指標，如HLA-DR,CD27