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文檔簡介
1、血管性癡呆(vascular dementia VD)是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的老年期癡呆。隨著生活水平的不斷提高,人們的生活方式,飲食結構發(fā)生了巨大變化,導致腦血管病的發(fā)生率一直居高不下,因此VD的發(fā)病率也在逐年提高,流行病學調查顯示,歐美國家癡呆患者中的10%-20%為VD,在我國,VD的發(fā)病率為1.1%-3.0%,年發(fā)病率為5‰-9‰。血管性癡呆因其高發(fā)病率,高致殘率而嚴重影響老年人的身體健康和生活質量,但其治療卻缺乏有效的方法
2、。因此,以從中醫(yī)藥中探索對血管性癡呆有效的治療方法為目的,我們開展了本項研究。
目的:
觀察中藥復方參麻益智方對VD模型大鼠包括血腦屏障、神經元、膠質細胞在內的神經血管單元的影響,從而探索參麻益智方治療血管性癡呆的作用機制。
方法:
分組、造模與給藥
選用清潔級Wistar大鼠70只,雄性,10周齡,體重300±40g,將大鼠隨機分為7組,每組10只,分別為空白組、假手術組、模型組、多奈
3、哌齊組、參麻益智方中藥低劑量組,中藥中劑量組和中藥高劑量組。模型組、多奈哌齊組、中藥各組以大鼠自體微血栓栓塞法造成大鼠多梗死性癡呆模型;假手術組注射0.3ml生理鹽水,余同模型組。造模結束后多奈哌齊組予0.5mg/kg藥物灌胃,中藥低劑量組予藥物3.3mg/kg灌胃,中藥中劑量組予藥物6.6mg/kg灌胃,中藥高劑量組予藥物16.5mg/kg灌胃,假手術組、模型組給予等量蒸餾水灌胃。每日灌胃一次,連續(xù)給藥4周。
實驗一參麻益智
4、方對VD模型大鼠行為學及海馬病理形態(tài)的影響
1方法:
給藥結束后采用ZS-001型Morris水迷宮系統(tǒng)檢測各組大鼠的學習記憶能力。實驗第1-5日進行空間探索實驗,上午將大鼠從規(guī)定入水點放入水中,開始記錄,待大鼠爬上平臺(各部位都位于平臺上)為結束時間,每組依次進行,每天從不同入水點重復四次后結束。第6日上午進行定位航行實驗,從南側入水點放入大鼠,記錄大鼠穿過原來放置平臺位置的次數,第四象限活動時間以及第四象限活動路
5、程。
水迷宮結束后每組大鼠斷頭取全腦,固定、石蠟包埋、切片,行常規(guī)HE染色和尼氏染色。
2結果:
2.1空間探索實驗
與空白組相比,假手術組大鼠各天的逃避潛伏期差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05);與假手術組相比,模型組大鼠各天的逃避潛伏期明顯延長,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相比,多奈哌齊組與參麻益智方高、中劑量組大鼠各天的逃避潛伏期明顯縮短,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.
6、05)。
2.2定位航行實驗
與空白組相比,假手術組大鼠的穿臺次數(passing platform times,PPT)與第四象限活動時間與路程的差異沒有統(tǒng)計學意義;與假手術組相比,模型組大鼠穿臺次數明顯減少,第四象限活動時間變短,第四象限活動路程減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相比,多奈哌齊組與參麻益智方中藥高劑量組穿臺次數顯著增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與假手術相比,多奈哌齊組與中藥
7、高劑量組第四象限活動路程增加;中藥組的第四象限活動時間雖然有增加的趨勢,但差異沒有統(tǒng)計學意義。
2.3 HE染色
100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)可見空白組及假手術組錐體細胞排列致密、有序、層次分明,細胞形狀規(guī)則,核仁清晰;模型組錐體細胞減少甚至消失,排列無序,細胞間隙增大,細胞形狀不規(guī)則;多奈哌齊及參麻益智方中藥高、中劑量組海馬的錐體細胞較模型組細胞數量增多,排列整齊,細胞間隙減小。
2.4尼氏(Niss
8、l)染色
100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)可見空白組、假手術組Nissl小體體積大,數量多,深染;模型組Nissl小體數量明顯減少、甚至消失,體積變小,染色變淺;多奈哌齊組及參麻益智方中藥高、中劑量組尼氏小體的數量、體積又有不同程度的增加,顏色加深。
3結論:
參麻益智方可改善VD模型大鼠空間學習記憶能力。
參麻益智方可減輕VD模型大鼠海馬組織細胞的損傷。
實驗二參麻益智方對VD模型大鼠
9、海馬組織NVU中血管新生的影響
1方法:
1.1 western blot法檢測VD大鼠海馬組織中HIF1α和Notch蛋白含量
1.2 ELISA法檢測VD模型大鼠海馬組織VEFG含量
1.3 RT-PCR法檢測VD模型大鼠海馬組織VEGF mRNA含量
1.4免疫組化法檢測VD大鼠海馬組織MVD
2結果:
2.1 HIF1α和Notch蛋白含量
與空白組
10、相比,假手術組的HIF1α、Notch蛋白的表達改變,無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與假手術組相比,模型組的HIF1α、Notch的蛋白表達稍有升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相比,多奈哌齊組HIF1α、Notch的蛋白表達改變無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組相比,參麻益智方高、中劑量組均可提高HIF1α、Notch的蛋白表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
2.2 VEFG含量
與空白組相
11、比,假手術組的VEGF表達改變無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與假手術組相比,模型組的VEGF的蛋白表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組相比,多奈哌齊組VEGF的蛋白表達改變無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組相比,參麻益智方中藥高劑量組可顯著提高VEGF的蛋白表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
2.3 VEGFmRNA含量
與空白組相比,假手術組的VEGFmRNA表達改變,無統(tǒng)計學意義(P>0
12、.05);與假手術組相比,模型組的VEGFmRNA的表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組相比,多奈哌齊組VEGFmRNA的表達改變無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組相比,參麻益智方中藥高劑量組可顯著提高VEGFmRNA的表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
2.4微血管密度(MVD)
200倍顯微鏡下觀察VD大鼠海馬組織CA1區(qū),與空白組相比,假手術組的MVD改變,無統(tǒng)計學意義(P>0.05)
13、;與假手術組相比,模型組的MVD升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組相比,多奈哌齊組MVD改變無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組相比,參麻益智方中藥高劑量組可顯著提高MVD,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
3結論:
參麻益智方可以促進VD模型大鼠海馬組織HIF1α、VEGF、Notch的蛋白表達。
參麻益智方對VD模型大鼠海馬組織VEGFmRNA的表達具有促進作用。
參麻益智方
14、可提高VD大鼠海馬組織MVD。
實驗三參麻益智方對VD模型大鼠海馬組織NVU神經元及膠質細胞的影響
1.方法:
1.1 western blot檢測VD模型大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、caspase3蛋白表達
1.2 RT-PCR檢測VD模型大鼠海馬組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA的表達
1.3比色法檢測VD模型大鼠海馬組織CAT、GSH、GSH-PX、SOD的活性MDA的
15、含量
1.4 Elisa檢測VD模型大鼠海馬組織IL-1、TNF-α蛋白表達
1.5免疫組化法檢測VD模型大鼠海馬組織iba-1、GFAP、Neun
2結果:
2.1Nrf2、HO-1、caspase3蛋白
與空白組相比,假手術組Nrf2、HO-1、caspase3的蛋白表達輕度升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01);與假手術組相比,模型組Nrf2、HO-1、caspase
16、3的蛋白表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相比,多奈哌齊組HO-1蛋白表達輕度升高、caspase3的蛋白表達下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組相比,參麻益智方中藥中、高劑量組Nrf2、HO-1的蛋白表達升高、caspase3的蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。
2.2 Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA
與空白組相比,假手術組Nrf2mRNA、HO-1
17、 mRNA表達的改變無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與假手術組相比,模型組的Nrf2mRNA、HO-1mRNA的表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.01);與模型組相比,多奈哌齊組Nrf2 mRNA、HO-1mRNA的表達改變無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組相比,參麻益智方中藥高、中劑量組Nrf2 mRNA、參麻益智方中藥高劑量組HO-1 mRNA的表達改變差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
2.3 CAT、
18、GSH、GSH-PX、SOD的活性、MDA的含量
與空白組相比,假手術組的CAT、GSH、GSH-PX、SOD的活性、MDA的含量改變,無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與假手術組相比,模型組的CAT、GSH、GSH-PX、SOD的活性減弱,MDA的含量升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相比,多奈哌齊組GSH、GSH-PX、SOD的活性增強,MDA的含量下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01),CAT的活
19、性改變差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組相比,參麻益智方中、高劑量組CAT、GSH、GSH-PX、SOD的活性增強,MDA的含量下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。
2.4 IL-1、TNF-α蛋白
與空白組相比,假手術組IL-1、TNF-α的蛋白含量改變,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與假手術組相比,模型組IL-1、TNF-α的蛋白含量升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相
20、比,多奈哌齊組IL-1的蛋白含量改變無統(tǒng)計學意義(P>0.05),TNF-α含量減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組相比,參麻益智方高劑量組可顯著降低IL-1、TNF-α蛋白的含量,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。
2.5小膠質細胞,星形膠質細胞和神經元的免疫組化結果
100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)小膠質細胞,空白組、假手術組小膠質細胞胞體小,有細長的突起,數量較少,模型組小膠質細胞胞體
21、變圓,分支減少,數量明顯增多,多奈哌齊組與參麻益智方中藥高、中劑量組小膠質細胞較模型組數量減少,突起較長,胞體變小。
100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)星形膠質細胞,空白組、假手術組小膠質細胞胞體較大呈圓形或橢圓形,有突起較多,數量較少,模型組星形膠質細胞胞體變大,突起變粗,數量增多。多奈哌齊組與參麻益智方中藥高、中劑量組星形膠質細胞較模型組數量減少,突起變細,胞體變小。
100倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經元細胞,空
22、白組、假手術組細胞排列整齊,細胞間隙小,細胞形態(tài)規(guī)則,細胞數量較多;模型組和參麻益智方低劑量組細胞排列較假手術組紊亂,細胞間隙增大,細胞形態(tài)不規(guī)則,細胞數量減少;與模型組相比,多奈哌齊組、參麻益智方高、中劑量組細胞排列整齊,細胞間隙變小,細胞形態(tài)相對規(guī)則。
3結論:
參麻益智方可提高VD模型大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白的表達,提高CAT、GSH、GSH-PX、SOD的抗氧化活性,降低IL-1、TNF-α表達,降
23、低海馬組織MDA含量,降低caspase3的蛋白表達。具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用,從而保護海馬神經元和膠質細胞。
參麻益智方可減少VD模型大鼠海馬組織iba-1標記的小膠質細胞、GFAP標記星形膠質細胞數量,抑制小膠質細胞和星形膠質細胞激活。
參麻益智方可減輕VD模型大鼠海馬組織神經元的損傷。
實驗四參麻益智方對VD模型大鼠海馬組織NVU物質信息交換的影響
方法:
Western b
24、lot法檢測VD模型大鼠海馬組織CX43、AQP4蛋白表達
結果:
與空白組相比,假手術組的CX43蛋白表達稍增加(P<0.01),AQP4表達改變無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與假手術組相比,模型組的CX43、AQP4的蛋白表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相比,參麻益智方高、中劑量組可降低CX43、AQP4的蛋白表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
結論:
參麻益智方
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