1、研究背景和目的：腎癌約占所有腫瘤的3％，其死亡率高達(dá)40%，近年來(lái)腎癌的發(fā)病率每年穩(wěn)步增長(zhǎng)2~4%，增長(zhǎng)速度較快。當(dāng)前對(duì)于腎癌的治療方法，雖然醫(yī)學(xué)界一致認(rèn)為腎癌根治術(shù)是可能治愈腎癌的一種方法,但這僅僅是對(duì)于那些臨床分期處于較早階段的腎癌有比較良好的效果。在臨床上仍有相當(dāng)部分的患者就診時(shí)已出現(xiàn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、靜脈癌栓等晚期表現(xiàn)，手術(shù)不能將體內(nèi)的腫瘤完全切除，手術(shù)效果不佳，病人的5年生存率不高，即使患者進(jìn)行了根治性手術(shù)切除，仍然有20%-30%

2、患者術(shù)后3年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移；再加上腎癌本身對(duì)傳統(tǒng)放、化療并不敏感，從而使得手術(shù)無(wú)法切除的晚期腎癌患者治療較為困難，預(yù)后較差。因此研究腎癌增殖的發(fā)生機(jī)制對(duì)應(yīng)用越來(lái)越廣泛的分子靶向治療尤為必要。
　　Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶2（Rock2）在Rho/Rock信號(hào)傳導(dǎo)通路中起關(guān)鍵作用，它對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮巨大的作用。而A類清道夫受體5型（SCARA5），與全身多種腫瘤的形成、侵襲及轉(zhuǎn)移等有關(guān)，被稱為“低調(diào)的抑癌基因”，對(duì)腫瘤

3、細(xì)胞的增殖起抑制作用。這兩個(gè)基因作用非常廣泛而重要，與人體許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腎癌是一種增殖能力很強(qiáng)的腫瘤，推斷Rock2很有可能通過(guò)調(diào)節(jié)SCARA5的表達(dá)來(lái)調(diào)控腎癌細(xì)胞的增殖。前期通過(guò)基因芯片篩選在腎癌細(xì)胞中降低Rock2表達(dá)可導(dǎo)致SCARA5表達(dá)升高。本研究首先檢測(cè) Rock2在臨床腎癌患者組織中的表達(dá)，同時(shí)回顧性分析這些腎癌患者的臨床特點(diǎn)及預(yù)后，從而分析 Rock2與腎癌患者生存率之間的關(guān)系；其次通過(guò)體外、體力實(shí)驗(yàn)明確Ro

4、ck2調(diào)控SCARA5表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的影響；最后探討Rock2如何調(diào)控SCARA5的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法：
　　1、通過(guò)運(yùn)用熒光定量 PCR、Western blot以及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)我院2002年1月至2010年1月行手術(shù)切除的118例腎癌組織、癌旁組織以及腎癌786-O、769-1和Caki細(xì)胞系中Rock2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，電話隨訪腎癌患者，并回顧性分析所有患者的臨床病理特點(diǎn)

5、，總結(jié)出Rock2表達(dá)與腎癌患者臨床病理特點(diǎn)及生存率之間的關(guān)系；
　　2、降低腎癌細(xì)胞中 Rock2的表達(dá)，利用EDU和平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察腎癌細(xì)胞增殖能力的改變；將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRock2的腎癌細(xì)胞株和未轉(zhuǎn)染的腎癌細(xì)胞株建成裸鼠皮下人腎癌瘤模型，觀察荷瘤鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)變化；
　　3、在沉默和過(guò)表達(dá)腎癌細(xì)胞中Rock2的表達(dá)后運(yùn)用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)腎癌細(xì)胞中SCARA5 mRNA和蛋白表達(dá)變化；在腎癌細(xì)

6、胞中沉默Rock2表達(dá)的同時(shí)抑制SCARA5的表達(dá)及在腎癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Rock2的同時(shí)增加SCARA5的表達(dá)，觀察ROCK2、SCARA5表達(dá)的變化以及腎癌細(xì)胞增殖能力的改變；
　　4、利用免疫共沉淀方法證實(shí)Rock2是否直接作用于SCARA5，western blot及熒光素酶基因報(bào)告的實(shí)驗(yàn)方法證明Rock2調(diào)控SCARA5的表達(dá)是通過(guò)β-catenin/TCF4通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)果：
　　1、Rock2在71例

7、腎癌組織中呈高表達(dá)（陽(yáng)性率60.2%），僅在25例癌旁組織表達(dá)（陽(yáng)性率21.2%）；Rock2的陽(yáng)性表達(dá)差異與腎癌患者的年齡、性別、癥狀、腫瘤大小和部位、是否有腎上腺或者組織學(xué)上的血管侵犯以及腫瘤是否有壞死無(wú)關(guān)，但與腫瘤的臨床分期、病理分級(jí)、危險(xiǎn)系數(shù)以及腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)；該基因的陽(yáng)性表達(dá)與腎癌患者中低生存率組密切相關(guān)。
　　2、將shRock2轉(zhuǎn)染到腎癌786-O細(xì)胞和769-1細(xì)胞中或者將Rock2的特異抑制劑(Y27632)加

8、入到這兩種細(xì)胞中后，腎癌細(xì)胞的增殖顯著降低；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默 Rock2表達(dá)轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞后所建立的裸鼠皮下腫瘤比空白質(zhì)粒對(duì)照組轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞形成的皮下腫瘤在體積和重量方面都顯著降低。
　　3、實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)沉默降低腎癌786-O和769-1細(xì)胞中ROCK2的表達(dá)后， SCARA5 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高；而穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ROCK2后， SCARA5mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低。相反，降低SCARA5的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)沉默Rock2表達(dá)引起的腎

9、癌細(xì)胞增殖能力的降低；提高SCARA5的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)Rock2過(guò)表達(dá)引起的腎癌細(xì)胞增殖能力的增強(qiáng)。
　　4、免疫共沉淀、熒光素酶基因報(bào)告和Western blot證實(shí)在ROCK2調(diào)控腎癌細(xì)胞的增殖過(guò)程中Rock2不與SCARA5直接作用，它調(diào)控SCARA5的表達(dá)是通過(guò)β-catenin/TCF4信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論：Rock2能夠調(diào)控腎癌細(xì)胞的增殖，它的機(jī)制是通過(guò)β-catenin/TCF4通路作用SCARA5來(lái)實(shí)現(xiàn)的