1、研究目的:
　　初步探討脾氣虛證臨床癥候與sAA活性比值之間的關聯(lián)性;通過對兩種不同系統(tǒng)疾?。詼\表性胃炎與重癥肌無力），脾氣虛證（虛證）、脾虛濕熱證（虛實夾雜）及肝胃不和證（實證）患者sAA活性、N-糖基化蛋白表達及N-糖鏈亞型構成比的觀察，以健康志愿者為對照，在分子水平探討脾氣虛證患者sAA活性改變的機制，為祖國醫(yī)學“脾主涎”理論的科學內涵提供依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.研究對象
　　符合診斷標準的MG

2、患者61例，其中脾氣虛證患者33例，脾虛濕熱證患者23例，脾腎虧虛5例（因例數(shù)較少，暫未分析其指標）;慢性淺表性胃炎患者101例，其中脾氣虛證患者36例，脾虛濕熱證患者40例，肝胃不和證25例，同時選取健康志愿者36例。
　　2.研究方法
　　2.1 受試患者情況分析
　　建立MG及CSG各證型患者的臨床癥候表現(xiàn)數(shù)據(jù)庫，進行頻次及逐步回歸分析，觀察不同中醫(yī)證型的癥候表現(xiàn)，作為癥候與sAA活性關聯(lián)性研究的基礎。
　

3、　2.2 唾液樣本采集
　　使用專用唾液采集管，以口內轉動棉柱法采集唾液樣本。按住院部患者（MG患者）與門診患者（CSG患者）時間安排在不同的時間采集，MG患者于6:30～7:30am采集，CSG患者于9:00～10:30am采集，健康志愿者也分為這兩個時間段采集以確保可與患者組在同一時間段平行比較各指標。采集的唾液樣本經(jīng)離心后取上清液，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2.3 sAA活性檢測
　　采用Bernfeld方法檢測s

4、AA活性，同時計算sAA活性比值（酸負荷后sAA活性/酸負荷前sAA活性）。
　　2.4 初步分析sAA活性比值與臨床癥候之間的關聯(lián)性
　　通過逐步線性回歸分析法初步探討臨床癥候與sAA活性比值之間的關聯(lián)性。
　　2.5 健康者及各證型患者sAA糖基化程度研究
　　采用western blot法，以人sAA生物標準品為參照，對比觀察健康者及各證型患者sAAN-糖蛋白表達，分析各證型患者sAAN-糖基化蛋白缺失情況

5、。
　　2.6 sAAN-糖鏈亞型構成比分析
　　檢測健康者及MG與CSG各證型患者與刀豆凝集素(conA)及麥胚凝集素(WGA)結合前后的sAA活性，并按公式:與凝集素的結合率=[（結合前sAA活性-結合后sAA活性）/結合前sAA活性]×100％，計算sAA與conA及WGA的結合率;進一步以conA與WGA進行凝集素親和層析實驗，分析N-糖鏈中高甘露糖型、雜合型及復合型糖鏈的構成比情況。
　　2.7 植物凝集素的

6、篩選
　　定制凝集素芯片，篩選出與健康組、MG脾氣虛證及脾虛濕熱證患者sAA結合區(qū)別較大的凝集素，并再次以lectin Blot法進行驗證，為下一步深入研究sAAN糖鏈類型研究打下基礎。
　　研究結果：
　　1.受試者一般資料
　　CSG患者101例，年齡21-60歲，平均年齡40.1±12.1歲，男性44例，女性57例，其中脾氣虛證患者36例，脾虛濕熱證患者40例，肝胃不和證患者40例;MG患者61例，年齡20

7、-65歲，平均48.1±14.7歲;男性24例，女性37例，其中脾氣虛證患者33例，脾虛濕熱證患者23例，脾腎虧虛證患者5例（因脾腎虧虛證患者例數(shù)較少，故暫未分析其指標）。健康志愿者36例，年齡20-35歲，平均年齡28.3±5.8歲。
　　2.CSG與MG各證型患者臨床癥候結果
　　CSG脾氣虛證患者以舌淡、脈浮細弱、唇色暗淡、呃逆、食后腹脹、身重困倦、噯氣、腸鳴音亢進、脘腹疼痛、肢體倦怠、大便溏泄等癥出現(xiàn)頻率較高;脾虛濕

8、熱型患者以舌紅、脈沉濡數(shù)、唇色暗淡、胃脘脹滿、食后腹脹、身重困倦、噯氣、呃逆等癥多見;肝胃不和型主癥表現(xiàn)為:脈弦，舌淡，脘腹脹滿或疼痛、噯氣、情志抑郁等癥。其中脾氣虛證患者食后腹脹、呃逆、口泛清涎、舌淡、脈浮細弱等癥的出現(xiàn)顯著頻率高于脾虛濕熱證及肝胃不和證患者(P＜0.01)。
　　MG脾氣虛證患者多見脈浮細弱、舌淡、眼瞼下垂、表情呆板、四肢無力、眼球活動不靈活、多汗、面色晦暗、神疲懶言、食欲減退等癥;脾虛濕熱證患者多見脈沉濡弱、

9、多汗、咀嚼無力、表情呆板、四肢無力、面色晦暗、身重困倦、渴欲飲水等癥。脾氣虛證患者食欲減退、口泛清涎、舌淡、脈浮細弱、眼瞼下垂、眼球活動不靈活等癥的出現(xiàn)頻率顯著高于脾虛濕熱證(P＜0.01)，此結果可為進一步探討脾氣虛證臨床癥候與sAA活性比值之間關系的基礎。
　　3.sAA活性檢測結果
　　健康志愿者酸負荷后sAA活性升高，CSG、MG脾氣虛組與脾虛濕熱組患者酸負荷后sAA活性下降，CSG肝胃不和組患者酸負荷后sAA活性升

10、高;CSG、MG脾氣虛證及脾虛濕熱證患者sAA活性比值（酸負荷后/酸負荷前）與健康組相比明顯降低(P＜0.05)，CSG肝胃不和組患者sAA活性比值與健康組相比無差異。提示脾虛病理狀態(tài)（包括脾虛濕熱）在酸負荷前sAA活性可代償性升高，而應激力下降，導致在酸負荷后sAA活性的下降，sAA活性比值降低。
　　4.臨床癥狀與sAA活性比值的關聯(lián)性結果
　　通過逐步線性回歸分析發(fā)現(xiàn)CSG脾氣虛證患者sAA活性比值與食后腹脹、脘腹疼痛

11、、呃逆三個癥候關聯(lián)性較大，且均呈負相關;MG脾氣虛證患者sAA活性比值與口泛清涎、食欲減退、眼瞼下垂三個癥候關聯(lián)性較大，且呈負相關。CSG、MG其它證型均未發(fā)現(xiàn)與sAA活性比值有明顯相關性的癥候。因此提示脾氣虛證患者的某些臨床癥候與sAA活性比值之間的關系較其它證型更為密切。
　　5.sAAN-糖基化研究
　　5.1 sAAN-糖基化程度分析
　　56.7％(17/30)的MG脾氣虛患者與36.4％(8/22)的MG脾

12、虛濕熱患者出現(xiàn)sAAN-糖基化蛋白表達缺失，明顯高于健康組的11.1％(4/36)(P＜0.05)，25.0％(8/32)CSG脾氣虛證及31.7％(13/41)的CSG脾虛濕熱證出現(xiàn)sAAN-糖基化蛋白表達缺失，明顯高于健康組的11.1％(P＜0.05)，而CSG肝胃不和證患者sAA N-糖基化蛋白缺失比例為8.7％(2/23)，與健康者無差異，提示脾氣虛證及脾虛濕熱證患者sAAN-糖基化蛋白表達缺失是sAA活性改變的病理背景之一。<

13、br>　　5.2 sAAN-糖鏈亞型結構分析結果
　　5.2.1 各組sAA與conA及WGA結合率結果比較
　　sAA與conA及WGA結合率比較結果顯示，MG脾氣虛組、脾虛濕熱組與CSG脾氣虛組、脾虛濕熱組患者酸負荷前、后sAA與conA的結合率均明顯高于健康者組(P＜0.05)，提示脾氣虛證及脾虛濕熱證患者sAA中高甘露糖型及雜合型（生物活性較弱）蛋白構成比高于健康者組;MG脾氣虛組、脾虛濕熱組及CSG脾氣虛組、脾虛濕

14、熱組患者酸負荷前、后sAA與WGA結合率均低于健康組（P＜0.05），說明復合型糖鏈（生物活性較強）的構成比低于健康組，CSG肝胃不和組患者sAA與conA及WGA的結合率與健康組相比均無明顯差異，說明實證患者sAA糖鏈結構無明顯改變。
　　5.2.2 各組sAA與conA及WGA親和層析結果比較
　　MG、CSG脾氣虛組及脾虛濕熱組患者sAA與conA親和層析結果分別顯示弱結合峰面積與強結合峰面積峰面積高于未結合峰面積峰面

15、積，說明脾氣虛組及脾虛濕熱組患者sAA中高甘露糖及雜合型糖鏈構成比大于復合型糖鏈。MG、CSG脾氣虛組與脾虛濕熱組患者sAA與WGA親和層析結果顯示，脾氣虛組患者未結合峰面積高于結合峰面積，脾虛濕熱組患者結合峰面積高于未結合峰面積，說明脾氣虛組患者sAA中復合型糖鏈構成比降低，脾虛濕熱證患者sAA中雜合型與復合型糖鏈構成比升高。綜合sAA與conA層析結果可推測脾氣虛組患者sAA中生物活性較弱的高甘露糖型糖鏈構成比較高，脾虛濕熱組患者s

16、AA中雜合型糖鏈構成比較高。結果提示， N-糖鏈中生物活性較弱的高甘露糖型糖鏈含量升高、生物活性較強復合性糖鏈含量降低是sAA活性下降的因素之一。
　　6.其他植物凝集素的篩選
　　6.1 LectinTM凝集素芯片結果
　　與健康組相對照，發(fā)現(xiàn)番茄凝集素(LEL)、馬鈴薯凝集素(STL)與麥胚凝集素(WGA)3個凝集素在健康組、重癥肌無力脾氣虛證及脾虛濕熱證患者唾液樣本中具有一定的區(qū)分能力，其中WGA在3組樣本中表現(xiàn)

17、出較大的差異?？蛇M選用這三種凝集素進行下一步的深入研究。
　　6.2 凝集素芯片驗證結果
　　通過Lectin blot實驗發(fā)現(xiàn)脾虛濕熱證患者sAA與WGA、LEL、STL結合的糖蛋白表達均高于健康者，比較三種凝集素結合糖鏈特異性可推斷本組MG脾虛濕熱證患者sAA中含有GlcNAc糖鏈結構增多。提示W(wǎng)GA、LEL、STL所結合的糖蛋白在健康者與MG脾虛濕熱者之間有明顯的區(qū)分能力，可用于進一步深入研究sAA糖鏈結構類型。