1、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）屬黃病毒科，是單股正鏈RNA病毒，基因組全長約9.6Kb，兩端是空間結(jié)構(gòu)保守的非編碼區(qū)，中間是一個可以編碼約3000個氨基酸的多聚蛋白前體的開放閱讀框。HCV感染后慢性化程度高，并且可引發(fā)嚴重的肝損傷，進一步導致肝纖維化、肝硬化以及肝細胞癌等嚴重肝病。HCV被發(fā)現(xiàn)后30年以來，隨著科學研究的逐漸深入，其防治也取得了一些重要的進展，如小分子直接抗病毒藥物的研發(fā)取得的重大突破；然而

2、，我們也應該看到目前HCV新藥都是由國外研發(fā)且價格昂貴，國內(nèi)絕大多數(shù)的慢性 HCV感染者都難以承受?？紤]到這些原因以及 HCV感染后病情發(fā)展的隱匿性，有效的疫苗對HCV感染的控制仍然極為重要。
　　在HCV的防治研究過程中，細胞模型的地位十分重要，它極大的促進了基礎研究和新藥開發(fā)。然而即使目前最常用的肝癌細胞系培養(yǎng)模型也存在感染效率低、不能被臨床毒株感染等諸多不足。因此，發(fā)展可以較好地支持細胞培養(yǎng)HCV和臨床HCV毒株感染并產(chǎn)生與

3、體內(nèi)感染相似的過程和反應，具有可重復性、可控性和可靠性并符合倫理學要求的細胞模型是目前HCV模型的主要發(fā)展方向。理想的細胞模型建立，將為深入研究病毒的致病機制、病毒與宿主相互作用、病毒變異性以及抗病毒藥物的篩選和預防疫苗的研究奠定基礎。
　　本研究基于以上的分析提出：利用具有干細胞功能的人胚胎肝干細胞（human Fatal liver stem cells, hFLSCs）建立高效的血清來源的HCV（blood-borne HC

4、V, bbHCV）培養(yǎng)系統(tǒng)。在此系統(tǒng)中模擬bbHCV體內(nèi)感染過程中的吸附、侵入、RNA復制、蛋白質(zhì)合成、病毒組裝和分泌以及子代病毒再感染的整個生命過程；利用數(shù)學模型闡述病毒在細胞內(nèi)的增殖和分泌規(guī)律；觀察類似于HCV慢性感染者體內(nèi)的細胞病變并初步闡明其機制；利用此系統(tǒng)對已有的抗病毒藥物進行效果評價；利用蛋白質(zhì)組學技術在此系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)并驗證除目前已有的HCV感染相關受體之外的新的感染關鍵因子：受體蛋白酪氨酸磷酸酶A（Protein tyros

5、ine phosphatases, receptor type A, PTPRA）和載脂蛋白D（Apolipoprotein D, ApoD），并探討其在病毒侵入、復制、組裝和分泌過程中的機制。主要研究結(jié)果如下：
　　首先，以目前常用的免疫磁珠分離方法為對照，利用兩步原位灌流、IV型膠原酶消化、冰上重力沉淀、Percoll密度梯度離心相結(jié)合的方法（簡稱CSP）分離了高純度、高增殖活性的hFLSCs。所獲得的細胞分離3~5天之后開始

6、增殖呈鋪路石樣小細胞，10天之后進入對數(shù)生長期，而免疫磁珠分離的細胞需要花費2周形成單克隆，第3周才進入對數(shù)生長期；并且凍存不影響分離細胞的生長曲線、細胞表面標志物以及基因表達譜。細胞表面標志物表達譜和基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)兩種方法分離的hFLSCs在最初的10代培養(yǎng)過程中并無顯著性差異。當細胞傳至20代時，免疫磁珠分離的細胞表面 EpCAM、c-kit、CD44和OV-6這幾種干細胞標志物的表達明顯低于CSP所分離的細胞；兩種方法分離的細

7、胞c-kit、EpCAM、CK19、NCAM和CLDN3的mRNA表達譜在細胞傳代過程中表現(xiàn)一致，成熟肝細胞特異性基因PEPCK、TRF、CX26和C3A4在兩種方法所分離的細胞之間沒有顯著性差異，AFP和ALB的mRNA表達水平在15到20代之間，免疫磁珠分離細胞較之CSP分離細胞高。體外誘導實驗發(fā)現(xiàn) hFLSCs可以定向分化為功能性肝細胞和膽管細胞。
　　其次，我們利用hFLSCs建立了一個能完整模擬bbHCV感染細胞并在其中

8、繁殖的整個生命過程的培養(yǎng)系統(tǒng)，可以模擬包括病毒的吸附和侵入、RNA復制、蛋白質(zhì)合成、病毒組裝、有感染性的病毒顆粒的分泌以及特殊的類似于HCV慢性感染者體內(nèi)的肝細胞病變。利用3D-SIM熒光顯微鏡展示了HCV E2蛋白和細胞表面CD81受體的結(jié)合過程，而其特異的抗體則可以降低病毒的感染效率。此結(jié)果表明了hFLSCs可以模擬bbHCV自然感染的吸附和侵入。負鏈RNA的發(fā)現(xiàn)說明了bbHCV可以在hFLSCs中進行RNA的復制，細胞表面特異的H

9、CV蛋白的檢出則表明病毒可以在細胞內(nèi)完成蛋白的翻譯合成。進一步的結(jié)果還發(fā)現(xiàn)hFLSCs可以培養(yǎng)不同基因型的bbHCV（1a,1b,2a和3a型），特別是目前難培養(yǎng)的1b型HCV。病毒RNA復制可以部分的被Peginterferonα-2a和直接抗病毒藥物抑制，預示著這個培養(yǎng)系統(tǒng)可以被用于抗病毒藥物的篩選和評價。感染后的hFLSCs可以分泌出有感染性的子代病毒顆粒，通過動力學模型計算，我們得出bbHCV在hFLSCs內(nèi)部的倍增時間大約是2

10、h。利用普通和免疫電子顯微鏡：在bbHCV感染后的細胞內(nèi)和培養(yǎng)液中均發(fā)現(xiàn)典型的55nm左右的病毒粒子；bbHCV感染可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張紊亂、線粒體腫脹以及細胞空泡化形成等細胞病變，這些病變和HCV慢性感染者體內(nèi)的肝細胞病變類似。病變的機制可能為在感染的早期bbHCV誘導ER（Endoplasmic reticulum）應激和線粒體相關的caspase依賴的細胞凋亡；隨著時間的延長，NF-κB激活、bcl-XL表達增強，接著PI3-kina

11、se-Akt/PKB細胞增殖通路和 p53抗凋亡通路激活，最終導致細胞凋亡被抑制。同時，我們在bbHCV感染過程中發(fā)現(xiàn)固有免疫相關基因ISGs和miRNA（miRNA-21和miRNA-122）均被誘導升高，而敲除或轉(zhuǎn)入miRNA-21或miRNA-122則能抑制或增強bbHCV的復制，此結(jié)果表明了hFLSCs可以被用來研究病毒與宿主的相互作用，并為HCV的感染機制研究和治療提供新思路。
　　最后，我們在此基礎上利用蛋白質(zhì)組學技術

12、結(jié)合生物信息學分析，最終篩選和發(fā)現(xiàn)PTPRA和ApoD與bbHCV感染密切相關。針對目前已經(jīng)鑒定出的HCV特異性受體CD81、SR-BI、NPC1L1和EGFR，利用siRNA干涉后，可以部分降低bbHCV的感染效率。針對新鑒定的PTPRA和ApoD，bbHCV感染后RT-qPCR檢測PTPRA和ApoD的表達發(fā)現(xiàn)其明顯升高；siPTPRA可以降低病毒進入細胞的量，siApoD則減少了感染后病毒向細胞外分泌的量，但是細胞內(nèi)病毒 RNA卻

13、累積增高；并且 bbHCV感染后可激活胰島素信號通路，增加IRS和JNK的磷酸化，最終激活Akt導致細胞內(nèi)脂肪酸合成增加，細胞內(nèi)脂滴增多。PTPRA抑制劑Peroxyacid可以降低bbHCV及其子代病毒在hFLSCs和Huh-7.5.1中的感染，而PTPRA激動劑胰島素和TNF-α則作用相反。通過構(gòu)建PTPRA和ApoD表達質(zhì)粒（pEGFP-N1），發(fā)現(xiàn)bbHCV感染轉(zhuǎn)染PTPRA成功的hFLSCs后，病毒進入細胞的速率增加，達到平臺

14、期的時間縮短；而感染轉(zhuǎn)染ApoD的hFLSCs，可以觀察到病毒向細胞外分泌的速率增加，細胞外病毒可以在感染后18h到達平臺期，較之未轉(zhuǎn)染的24h有顯著差異。利用所構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對 bbHCV不感染的肝源 Huh-7和非肝源 vero細胞后發(fā)現(xiàn)：Huh-7細胞在轉(zhuǎn)染了PTPRA之后雖然對bbHCV表現(xiàn)出有一定的感染性，但是細胞分泌病毒的含量依然很低，而單獨轉(zhuǎn)染ApoD并未對Huh-7感染bbHCV有所改善；有趣的是vero細胞中表達PTP

15、RA可以使這一株完全不感染bbHCV的細胞對bbHCV產(chǎn)生感染性，但可惜的是感染后在細胞上清中只能檢測到104~105Copies/mL的病毒RNA。上述結(jié)果表明我們發(fā)現(xiàn)的PTPRA可能是bbHCV感染必要的一個輔助因子。
　　綜上所述，本研究致力于建立一個能對bbHCV整個生命過程進行模擬的體外細胞感染模型，解決目前缺乏能穩(wěn)定、有效模擬bbHCV自然感染過程的細胞模型的關鍵技術問題，在此基礎之上針對bbHCV感染的機制及關鍵點進