1、耳聾是臨床常見疾病，在耳聾人群中，由內耳毛細胞、聽神經及各級聽中樞不可逆損傷導致的感音神經性聾占重度耳聾的絕大部分。長期以來，對于感音神經性耳聾的治療手段有助聽器和人工耳蝸植入等，但這些方法并不能從根本上解決問題。人內耳耳蝸中只有約15000個毛細胞，外界聲音的過度刺激、化療、氨基糖苷類藥物的副作用及年齡的增長都能夠導致有功能的毛細胞數量減少。在人體內，毛細胞的不能再生直接導致聽力衰退與耳聾。而毛細胞位于封閉的內耳環(huán)境中，加之其數量有限

2、，這成為我們研究其損傷及再生機制的障礙。
　　誘導多能干細胞(iPSCs)技術的興起為臨床研究和治療耳聾提供了無限可能。這種技術能夠對多種體細胞進行重編程，并將其誘導為與胚胎干細胞具有相同全能性的多能性細胞，只要給予一定的分化條件，這種細胞就能在體外誘導分化為幾乎所有類型的細胞。這種技術直接規(guī)避了利用人胚胎干細胞進行研究的倫理問題;自體iPS細胞的產生也排除了免疫排斥的問題，使個體化醫(yī)療成為可能;構建的疾病來源的iPSC成為疾病研

3、究及藥物篩選的良好模型。目前已有多種疾病來源的人體細胞被重編程為iPS細胞，但耳聾來源的iPS細胞的建立未見報道。因此，本研究中采用誘導多能干細胞技術，完成了建立MYOTA突變的耳聾病人特異性iPS細胞株、向內耳毛細胞分化及基因矯正的研究。
　　第一部分:首先，我們從正常人、MYO7A基因雜合雙突變耳聾患者及其聽力表現為正常但MYO7A基因單突變的父親尿液中提取了尿液細胞，并將其誘導為iPS細胞;其次，我們對構建的三株iPS細胞全

4、能性進行了檢測分析。細胞形態(tài)、堿性磷酸酶染色、全能性基因表達、全能性標志蛋白免疫熒光、擬胚體形成及分化實驗、畸胎瘤形成實驗都表明，我們構建的三株iPS細胞均具有全能性。核型分析表明，我們構建的iPS細胞染色體結構正常，并未在誘導過程中受到破壞。最終結果表明，MYO7A突變的耳聾患者來源的尿液細胞與正常細胞一樣，都能被重編程為具有全能性的誘導多能干細胞。
　　第二部分:由于MYO7A在內耳耳蝸中只在毛細胞中表達，為了研究這一基因的突

5、變對毛細胞功能有何影響及具體致聾機制，我們將正常人、MYO7A突變耳聾患者及其父親的特異iPS細胞向內耳祖細胞及進一步向內耳毛細胞誘導分化。在誘導過程中，我們采用細胞單層貼壁法，分兩個階段進行。向內耳祖細胞誘導階段:通過添加FGF3和FGF10，使三株iPS細胞單層貼壁，誘導12天后，iPS細胞誘導分化為內耳神經樣祖細胞和內耳上皮樣祖細胞。早期內耳標志性基因表達檢測和蛋白免疫熒光檢測表明，三株iPS細胞成功分化為內耳祖細胞，并且各分化指

6、標在三株細胞間沒有顯著性差異。這表明，無論是正常的還是MYO7A突變的iPS細胞，都能被誘導分化為內耳祖細胞，三株細胞的分化表現趨向一致。向毛細胞誘導階段:我們將內耳上皮樣祖細胞分離出來，添加EGF和維甲酸，貼壁誘導3周后，對分化的細胞進行毛細胞標志性基因表達檢測及毛細胞標志性蛋白免疫熒光檢測，結果表明正常人、MYO7A突變耳聾患者及其父親來源的iPS細胞都能被誘導為毛細胞樣細胞，且三株分化的毛細胞樣細胞都表現了毛細胞特有的電生理功能。

7、但是，具有MYO7A雜合雙突變的分化的毛細胞對于FM1-43具有極低的內吞效率，電生理檢測中IK1和ICa與正常iPS細胞來源的毛細胞樣細胞相比顯著偏大，且其靜纖毛在聚攏成束中的表現與正常來源的毛細胞有明顯區(qū)別;利用western blot對myosin7a蛋白表達檢測表明，MYO7A突變導致了一個縮短了的myosin7a蛋白的產生。以上結果表明，MYOTA的突變是通過影響靜纖毛束的功能來使毛細胞功能失常。
　　第三部分:為了研究

8、利用體外細胞株進行基因矯正、以作為臨床應用的可行性，我們利用CRISPR-Cas9介導的同源重組技術，對MYO7A雜合雙突變來源的iPS細胞的其中一個突變位點進行基因矯正。在經過初步流式分選之后，測序分析和酶切驗證分析表明，有7.5％±1.3％的細胞被純合矯正。之后我們對十個潛在脫靶位點進行PCR測序分析，未見有脫靶現象。全能性檢測結果表明，矯正后的iPS細胞株仍具有iPS特異的全能性。這表明我們將雜合雙突變中的其中一個突變位點矯正成功

9、。將這一矯正后的細胞株向內耳毛細胞分化后，其在基因表達、蛋白表達等分化指標的表現與正常來源的iPS細胞分化的毛細胞樣細胞表現一致，說明經過基因矯正操作后的iPS細胞仍能分化為內耳毛細胞。對這一iPS細胞株分化的毛細胞樣細胞進行掃描電鏡觀察發(fā)現，靜纖毛重新聚攏成束;Westernblot檢測表明，myosin7a蛋白條帶與正常來源的毛細胞相同;分化的毛細胞中能夠內吞FM1-43FX的比例恢復正常水平;電生理檢測中，IK1和ICa恢復正常值