1、目的：
　　乳腺癌是世界范圍女性最常見的惡性腫瘤，占女性全部惡性腫瘤的22％左右，是危害女性健康的最主要的疾病之一。乳腺癌曾經在中國等發(fā)展中國家發(fā)病率較低，然而隨著社會、經濟、環(huán)境等諸多因素的變化，乳腺癌的發(fā)病率在全球范圍迅速增加，僅僅10年時間乳腺癌的總發(fā)病率提高了近10倍，乳腺癌在中國更是以每年2.7％的比例快速增長。流行病學資料顯示，基因的異常擴增和突變及遺傳易感性改變在乳腺癌的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用。近年來隨著對一些重要

2、癌基因和抑癌基因生物學功能的不斷深入研究，乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制被逐漸闡釋。
　　基于新的癌基因和腫瘤靶標的靶向治療也在乳腺癌的治療中發(fā)揮了重要作用，隨著分子分型及腫瘤精準醫(yī)療概念的提出，乳腺癌的研究正逐步從以往的循證治療、經驗治療向新的以全基因組測序和基因突變?yōu)閷虻膫€體化治療轉變，在這個大環(huán)境下，探索新的乳腺癌關鍵癌基因，發(fā)現其新的調控機制和生物學作用，并實現臨床轉化正成為近年來乳腺癌研究領域的重點和難點。
　　研究發(fā)

3、現，乳腺癌細胞來源于乳腺上皮細胞，能夠表達上皮細胞標志物，且存在上皮間質轉化現象;亦有報道稱在乳腺癌細胞系中上調間質細胞標志物波形蛋白(Vimentin)可以顯著提高乳腺癌細胞系的轉移能力，并與乳腺癌患者的不良預后密切相關。上述研究均提示EMT乳腺癌復發(fā)轉移及不良預后過程中發(fā)揮著重要的作用。在我們的前期研究中通過對過度表達或干擾PRR11的乳腺癌MCF-7細胞系及其對照細胞系蛋白和基因水平的檢測表明，PRR11與-catenin表達呈正

4、相關，提示我們PRR11在乳腺癌細胞系中可能正向調控Wnt/-catenin通路，介導乳腺癌細胞EMT，進而增強其轉移能力，并影響乳腺癌患者的預后。
　　乳腺癌是對女性健康威脅最大的腫瘤之一，至今其調控機制仍不十分清楚，除了ER/PR、HER2、Ki67外尚，可用于臨床診斷的預后標志物及治療方面有效的分子靶點還很缺乏。因此尋找乳腺癌治療靶標和預后標志物是目前乳腺癌研究的重要內容。PRR11作為一個重要的腫瘤相關信號調節(jié)蛋白，其對乳

5、腺癌及生長轉移的調控尚無報道。本課題將利用多種特征性乳腺癌細胞模型、腫瘤轉移模型系統(tǒng)研究PRR11在乳腺癌生長和轉移中的作用，揭示其對乳腺癌細胞生長轉移的調控及分子機制，并利用大規(guī)模乳腺癌樣本及其臨床病理資料和隨訪信息，系統(tǒng)分析PRR11與乳腺癌臨床病理特征和患者預后的關系，探討PRR11作為乳腺癌預后標志物的應用前景，最終為乳腺癌的診斷和治療提供新的靶標。
　　第一部分 PRR11在乳腺癌細胞和組織中的表達及其臨床意義
　

6、　目的:檢測PRR11在乳腺癌組織和細胞中的表達，分析PRR11表達與乳腺癌臨床病理特征的相關性，探討其預后預測意義。
　　方法:采用免疫熒光、實時熒光定量PCR和免疫印跡檢測PRR11在乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR3、MDA-MB-231和正常乳腺上皮細胞MCF-10A中的表達。采用實時熒光定量PCR、免疫印跡和免疫組織化學法檢測乳腺癌組織與正常組織中PRR11的表達差異，明確乳腺癌組織中PRR11的表達與腫瘤分期、增殖指數

7、、組織分級、分子分型等臨床病理特征的相關性。通過生存分析和Cox風險比例回歸模型探討PRR11對乳腺癌患者預后的預測意義。
　　結果:免疫熒光顯示PRR11主要表達于乳腺癌細胞漿內。實時熒光定量PCR和免疫印跡結果提示，PRR11的mRNA和蛋白質在乳腺癌組織和細胞系中的表達明顯高于正常乳腺組織和上皮細胞系。免疫組化結果顯示，PRR11高表達的乳腺癌組織中增殖標志物Ki67的表達明顯高于PRR11低表達的乳腺癌組織，PRR11的表

8、達隨著乳腺癌分期的提高而增加。PRR11的表達與腫瘤大小、遠處轉移、病理分期、孕激素受體狀態(tài)密切相關，但與年齡和淋巴結狀態(tài)無明顯相關性。生存分析提示，PRR11高表達患者生存期較低表達者明顯縮短，PRR11可作為乳腺癌患者獨立的不良預后的預測指標。
　　結論:PRR11在乳腺癌組織和細胞中的表達明顯高于乳腺正常組織和上皮細胞，乳腺癌組織中PRR11表達與增殖指數、是否轉移及腫瘤分期密切相關，其可作為PRR11可作為乳腺癌患者獨立的

9、不良預后的預測指標。
　　第二部分 PRR11表達調節(jié)對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響
　　目的:探討PRR11表達調節(jié)對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響
　　方法:構建慢病毒體介導的PRR11過表達和沉默體系，實現對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞系中PRR11表達的穩(wěn)定上下調。采用MTT、EdU、平板克隆和TUNEL實驗檢測PRR11表達調節(jié)對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響。篩選PRR11穩(wěn)定上調和沉默的乳腺癌MCF-

10、7細胞及各自對照細胞，構建裸鼠皮下種植瘤模型，檢測PRR11表達調節(jié)對體內腫瘤生長的影響。
　　結果:細胞功能實驗結果顯示，PRR11過表達的乳腺癌細胞活力、EdU陽性細胞百分比和平板克隆形成數目較對照組明顯升高，PRR11表達下調后乳腺癌細胞的上述生物學行為較對照組明顯受到抑制，且細胞凋亡數目較對照組明顯增多。荷瘤裸鼠模型結果顯示，PRR11表達上調后MCF-7細胞的成瘤體積、質量和Ki67的表達較對照組明顯升高，PRR11表達

11、下調后上述指標較對照組明顯降低。
　　結論:PRR11表達上調可促進乳腺癌細胞的增殖和體內成瘤能力;PRR11表達下調則會抑制乳腺癌增殖和體內成瘤，并可誘導細胞發(fā)生凋亡。
　　第三部分 PRR11表達調節(jié)對乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響
　　目的:探討PRR11表達調節(jié)對乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響
　　方法:采用慢病毒體介導的PRR11過表達和沉默體系，實現對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞系中PRR11表

12、達的穩(wěn)定上下調。采用細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測PRR11表達調節(jié)對乳腺癌細胞遷移和侵襲的影響。檢測PRR11表達上調后乳腺癌MCF-7細胞中上皮間質轉化(EMT)相關標志物(E-cadherin、Fibronectin和Vimentin)的改變。
　　結果:PRR11表達上調后，乳腺癌細胞的細胞劃痕愈合率和侵襲數量較對照組顯著提高，PRR11表達下調則會抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲。PRR11表達上調后MCF-7細

13、胞發(fā)生EMT改變，E-cadherin表達降低，Fibronectin和Vimentin表達升高。
　　結論: PRR11表達上調可促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，并誘導細胞發(fā)生上皮間質轉化，PRR11表達下調則會抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。
　　第四部分 PRR11調控乳腺癌細胞生長和轉移的分子機制
　　目的:探討PRR11調控乳腺癌生長和轉移的分子機制
　　方法:選取MCF-7細胞，采用免疫印跡和熒光定量

14、PCR檢測PRR11表達調節(jié)β-catenin及其下游信號分子cyclinD1、c-myc、E-cadherin和Vimentin表達的影響。通過雙熒光素酶報告基因實驗(TOP/FOP-flash)檢測對PRR11表達調節(jié)對β-catenin作為轉錄因子活性的影響。采用小干擾RNA下調β-catenin的表達后，免疫印跡和熒光定量PCR檢測β-catenin及其下游信號分子表達變化，TOP/FOP-flash檢測β-catenin的轉錄

15、因子活性，同時檢測細胞增殖和侵襲變化，驗證PRR11通過β-catenin通路調控乳腺癌細胞的增殖和侵襲。采用免疫組化檢測臨床乳腺癌標本中的PRR11和β-catenin表達的相關性。
　　結果:PRR11表達上調后，乳腺癌MCF-7細胞中β-catenin的總表達量和核內表達量均明顯升高，其調控的下游基因cyclinD1、c-myc、E-cadherin和Vimentin表達也較對照組升高，受β-catenin轉錄激活的質粒熒光

16、強度(TOP/FOP)明顯增強。反之，當PRR11表達下調后，上述分子的表達較對照組明顯降低。當同時下調3-catenin的表達后，PRR11上調所引發(fā)的cyclinD1、c-myc和Vimentin表達增加被抵消，而E-cadherin表達則有所恢復。此外，PRR11上調所引起的TOP/FOP比值升高也被抵消，MTT和Transwell實驗結果顯示，β-catenin表達下調可以抵消PRR11過表達所引起的MCF-7細胞增殖和侵襲能力