1、研究目的：
　　1.研究缺氧誘導因子2α(hypoxia inducible factor2α,HIF-2α)在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)簡稱肝癌患者腫瘤組織及血清中的表達，探討HIF-2α的表達與患者臨床病理因素、預后及血管生成之間的關系，探討血清中HIF-2α蛋白對于肝癌的診斷價值。
　　2.研究普通培養(yǎng)及氯化鈷模擬缺氧培養(yǎng)條件下人肝癌細胞株MHCC-97H、Hep3B、HepG

2、2、HCCLM3、Huh-7和人肝細胞HL-7702中HIF-2αmRNA及蛋白表達水平，并篩選合適細胞株進行后續(xù)研究。
　　3.研究RNA干擾HIF-2α基因表達后肝癌細胞功能學改變。
　　4.探討HIF-2α基因在肝癌中的作用機制。
　　研究方法：
　　1.收集具有完整病例及隨訪資料的90例患者肝癌組織標本，免疫組織化學法檢測肝癌組織中HIF-2α和血管生成相關指標VEGF、CD34的表達，探討HIF-2α的

3、表達與患者臨床病理因素、血管生成及生存預后的關系。酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA檢測患者術前血清中HIF-2α的表達，受試者工作曲線(Receiver operating characteristics,ROC)分析比較HIF-2α和血清AFP值單獨以及聯(lián)合對肝癌的診斷價值。
　　2.對人肝癌細胞株 MHCC97H、HepG2、HCCLM3、Hep3B、Huh-7以及人肝細胞HL-7702進行普通培養(yǎng)和氯化鈷模擬缺氧培養(yǎng)，運用實時熒光

4、定量PCR技術和Western blot法檢測各細胞株普通培養(yǎng)及缺氧模擬情況下HIF-2αmRNA及蛋白表達情況，并選取合適細胞株進行后續(xù)實驗。
　　3.HIF-2α特異性siRNA慢病毒感染人肝癌細胞株，使用RT-PCR檢測RNA干擾的有效性，確定siRNA干擾HIF-2α表達有效后進行細胞增殖、凋亡及侵襲實驗，初步探討HIF-2α在肝癌細胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等方面的作用。
　　4.采用affymetrix基因芯片檢測人

5、肝癌細胞HIF-2α基因表達下調(diào)后，全基因表達譜的變化，并應用T檢驗，找到成對樣本間的差異基因列表，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因進行pathway注釋，和GO分析即對差異基因進行biological process、molecular function以及cellular component注釋，對相關基因和信號通路進行綜合分析。
　　研究結果：
　　1.90例肝癌組織中HIF-2α陽性者69例(76.7％)，顯著高于癌旁組

6、織(11/90,12.2%)，且HIF-2α高表達的患者血管浸潤發(fā)生率高、腫瘤包膜多不完整、腫瘤TNM分期晚以及病理Edmondson分級高。HIF-2α的表達與腫瘤血管生成重要的促進因子VEGF的表達呈現(xiàn)顯著相關性(p<0.001)，且與肝癌組織中微血管密度(microvessel density,MVD)呈正相關(p<0.001)，提示HIF-2α可能促進肝癌血管生成。HIF-2α陽性表達的患者預后無復發(fā)生存期DFS(p<0.001

7、)和總生存期OS(p<0.001)均較陰性者差，多因素分析，HIF-2α高表達的患者的OS(p=0.030)和DFS(p=0.005)均顯著低于HIF-2α陰性表達者。肝癌患者術前血清中HIF-2α水平明顯增高，且其表達與血管浸潤、腫瘤包膜、腫瘤TNM分期、病理Edmondson分級以及肝硬化程度相關，ROC曲線分析提示HIF-2α聯(lián)合AFP可提高肝癌檢出率。
　　2.各肝癌細胞株和人肝細胞株缺氧培養(yǎng)較普通培養(yǎng)HIF-2αmRNA

8、表達水平無明顯差異，而普通培養(yǎng)時蛋白水平普遍較低，缺氧培養(yǎng)時則呈不同程度升高，人肝癌細胞株Hep3B升高最顯著，故用于后續(xù)實驗。
　　3.siRNA慢病毒感染Hep3B細胞后，RT-PCR檢測結果顯示HIF-2α基因表達顯著下調(diào)，MTT測定siRNA干擾組肝癌細胞生長抑制率顯著高于對照組；Annexin V-APC單染法流式細胞儀檢測結果顯示siRNA干擾組細胞凋亡數(shù)明顯增加。
　　4.RNA干擾人肝癌細胞株Hep3B中HI

9、F-2α表達后，基因表達譜芯片檢測差異表達的基因。結果發(fā)現(xiàn)1352個基因表達發(fā)生明顯改變，其中上調(diào)674個，下調(diào)基因數(shù)為678個。差異基因主要涉及30個信號通路，包括MAPK信號通路、Wnt信號通路、細胞凋亡、Notch信號通路等重要信號調(diào)節(jié)通路。
　　結論
　　1.人肝癌組織中HIF-2α高表達，其表達與血管浸潤、腫瘤包膜、TNM分期以及病理分級相關；HIF-2α的表達與腫瘤血管生成密切相關，可作為肝癌患者術后預后預測的獨

10、立危險因素；聯(lián)合血清HIF-2α和AFP檢測可提高肝癌檢出率；HIF-2α可能作為肝癌早期診斷及預后預測的潛在分子標記物。
　　2.缺氧培養(yǎng)條件下人肝癌細胞株和人肝細胞株HIF-2α的mRNA表達水平較普通培養(yǎng)無明顯改變，蛋白水平則不同程度提高，進一步證實了HIF-2α的表達是受氧依賴的轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，并篩選出人肝癌細胞株Hep3B用于后續(xù)實驗。
　　3.RNA干擾技術成功下調(diào)了人肝癌細胞株Hep3B中HIF-2α基因的表