1、目的：糖尿病神經(jīng)源性膀胱（Diabetic Neurogenic Bladder，DNB）是糖尿病引起的泌尿系統(tǒng)常見并發(fā)癥，因臨床治療缺乏針對性，只能暫時緩解癥狀，不能中止DNB的進展和恢復膀胱功能。神經(jīng)生長因子（Neuron Growth Factor，NGF）減少是DNB重要的致病因素。臨床試驗證實補充外源性NGF可有效改善DNB，但也存在NGF半衰期短、生物利用度低等問題。人臍帶間充質(zhì)干細胞（Human Umbilical Cor

2、d Mesenchymal Stem Cells，hUCMSCs）既具有多向分化潛能，又是一種良好的基因治療的載體細胞。本課題擬在構建含人NGF的重組慢病毒載體并轉(zhuǎn)染至人臍帶MSCs的基礎上，體外誘導分化含NGF的人臍帶MSCs成為神經(jīng)上皮祖細胞，使神經(jīng)上皮祖細胞持續(xù)穩(wěn)定表達NGF，從而使NGF和誘導分化后的人臍帶MSCs分別發(fā)揮基因治療和細胞治療作用，為下一步的實驗治療奠定基礎。
　　方法：1.從新生兒臍帶中提取hUCMSCs并

3、鑒定其基本生物學特性，采用細胞計數(shù)儀計數(shù)制作生長曲線、流式細胞儀鑒定hUCMSCs細胞表面抗原，免疫熒光方法驗證hUCMSCs的Nestin蛋白表達情況。
　　2、誘導hUCMSCs向成骨方向及成脂方向分化。檢測膠原表達、茜素紅染色及ALP并評價成骨分化效果。油紅O染色評價成脂分化效果。從而驗證hUCMSCs的多向分化能力。
　　3、過表達NGF的慢病毒載體構建，篩選最佳MOI后使用慢病毒轉(zhuǎn)染hUCMSCs。熒光顯微鏡拍照，

4、估算轉(zhuǎn)染效率。
　　4、利用添加bFGF、EGF的無血清D/F12培養(yǎng)基，經(jīng)過兩個階段誘導過表達NGF的hUCMSCs向神經(jīng)上皮祖細胞分化，采用形態(tài)學觀察、免疫熒光、RT-PCR、Western-Blotting、ELISA等多種方法評價誘導效果。
　　結(jié)果：1、原代 hUCMSCs細胞形態(tài)為長梭形，呈漩渦狀、魚鱗樣生長，倍增時間為32.1h，hUCMSCs表達間充質(zhì)表面抗原 CD105，CD29，CD13，CD90，不表達

5、CD45，CD14，CD106，CD34，HLA-DR。HLA-DR不表達證明hUCMSCs免疫原性低。
　　2、分別誘導分化hUCMSCs具有成骨和成脂分化潛能，證實hUCMSCs具有多向分化能力。
　　3、構建過表達NGF的慢病毒載體并成功轉(zhuǎn)染至hUCMSCs。
　　4、經(jīng)過兩步誘導法，過表達NGF的hUCMSCs轉(zhuǎn)變成大量神經(jīng)樣細胞團塊。免疫熒光染色神經(jīng)上皮祖細胞抗原標記Nestin和Musha-1高表達，RT-

6、PCR顯示Pax-6、Masha-1、Sox-1高表達。ELISA方法檢測到培養(yǎng)液中NGF的表達。
　　結(jié)論：
　　1.證實提取的新生兒hUCMSCs具有較高的增殖能力及多向分化能力，體外培養(yǎng)多代的hUCMSCs仍然具備干細胞的基本生物學特性且免疫原性低。
　　2.成功構建攜帶過表達NGF的慢病毒載體。
　　3.利用基因轉(zhuǎn)染技術成功構建過表達NGF的hUCMSCs，并在培養(yǎng)液中得到高效穩(wěn)定的表達。
　　4．