人肝再生增強因子在pichia pastoris中表達、純化及活性檢測.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:建立一套便于純化的肝再生增強因子真核表達系統(tǒng),為后續(xù)更好地研究肝再生增強因子的生物學功能奠定基礎。
  方法:
  1.用基因重組技術和聚合酶鏈反應( Polymerase chain reaction, PCR)方法,從重組質粒pPIC9K-rhALR中擴增出編碼rhALR的基因片段。純化后的rhALR基因和pPICZαA空質粒,分別經限制性內切酶XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切。酶切產物純化后進行DNA連接酶連接,構建重組

2、質粒pPICZαA-rhALR。
  2.經PCR、雙酶切和測序鑒定的重組質粒pPICZαA-rhALR,由限制性內切酶SacI單酶切線性化后電轉入酵母菌GS115中,在含博來霉素(Zeocin)的YPD平板上篩選陽性轉化子,隨后再在含Zeocin濃度遞增的 YPD板上篩選高拷貝子。酵母菌落 PCR鑒定后的高拷貝菌,在1%甲醇誘導下,分泌表達rhALR。表達上清蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳和Western Blot(ALR多克隆

3、抗體和His-tag標簽抗體)鑒定。
  3.表達上清經鎳柱親和層析純化,再用截留分子量為7kD的透析袋予以透析處理。SDS-PAGE凝膠電泳分析純化效果,BCA試劑測得目的蛋白濃度。
  4.MTS試劑檢測rhALR體外對人肝癌細胞(HepG2、QGY)的促增殖活性,及其對順鉑處理的QGY細胞增殖抑制率影響。流式細胞儀檢測rhALR在順鉑(DDP)誘導肝癌細胞株QGY凋亡時的抗凋亡作用。
  結果:
  1.成

4、功構建rhALR15kD亞型酵母表達重組質粒pPICZαA-rhALR。重組質粒經PCR、雙酶切及測序鑒定均與預期結果一致。
  2.成功構建 pPICZαA-rhALR GS115真核表達系統(tǒng)。在含 Zeocin2000μg/ml YPD板中篩出多顆高拷貝菌,菌落PCR鑒定重組菌為Mut+型,即甲醇利用正常型。rhALR被分泌表達于上清,占上清總表達蛋白的70%以上,Western Blot均可見單一的分子量約為17.5 kD的

5、條帶。
  3.SDS-PAGE凝膠電泳分析純化后產物,可見單一的,濃縮的目的蛋白條帶。BCA試劑測得超濾濃縮后目的蛋白濃度約為(800~1600)μg/ml。
  4.MTS試劑測得rhALR對HepG2細胞和QGY細胞的體外促增殖作用呈濃度依賴性增強,也可濃度依賴式緩解順鉑處理的QGY細胞增殖抑制率。而流式細胞儀檢測法測得其對順鉑誘導的人肝癌細胞亦有呈濃度梯度式的抗凋亡作用。
  結論:
  成功構建能高效分

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