1、目的:
　　腸癌居世界高發(fā)腫瘤第三位，嚴重威脅人類健康。盡管手術及輔助治療使一部分腸癌得到根治，但是仍有50％左右的患者會進展為晚期。靶向治療是晚期腸癌的主要治療手段之一。研究表明，抗表皮生長因子受體(EGFR)單克隆抗體與化療聯合能顯著延長腸癌患者的生存，而K-RAS基因狀態(tài)可成功地預測療效。但不容忽視的是，即使是K-RAS野生型的腸癌，也僅有55％-60％左右的患者能夠從抗EGFR單克隆抗體聯合化療中獲益，并且單藥有效率只有1

2、7％，提示除K-RAS突變狀態(tài)外，還有其他的耐藥機制存在。但非常遺憾的是，迄今為止，只有突變率很低的B-RAF及PIK3CA等分子被證實與臨床耐藥有關，大多數K-RAS野生型患者的耐藥機制仍是一團迷霧。
　　抗EGFR單克隆抗體的耐藥機制涉及機體多個信號轉導通路和靶點引起的多種變化，分為原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性（獲得性）耐藥。既往認為，原發(fā)性耐藥主要由于部分腫瘤細胞存在K-RAS或B-RAF等突變，使EGFR下游信號通路發(fā)生EGFR非依

3、賴性的異?；罨?。繼發(fā)性耐藥主要由于藥物長期作用，誘導敏感腫瘤細胞過度表達耐藥分子，或者治療過程中敏感腫瘤細胞發(fā)生了新的基因突變，腫瘤誘導的、非依賴于EGFR的血管生成，EGFR自身或配體轉化生長因子-α過度表達，EGFR泛素化，EGFR核轉位，EGFR變異體Ⅲ(EGFRvⅢ)，EGFR同其它跨膜蛋白形成異源二聚體，非受體酪氨酸激酶Src家族激酶(Src famny kinase，SFK) c-Src間接活化EGFR通路，以及繞開EG

4、FR通路的其它受體酪氨酸激酶的活化（如IGF-1R和HGF/MET通路）等。腫瘤源自宿主的正常細胞，經過多步細胞轉化而癌變，經過多次克隆選擇形成異質性。不同的腫瘤細胞亞群具有差異性的基因表達譜、蛋白表達譜，形成各異的腫瘤微環(huán)境。由于腫瘤是一群異質性很大的細胞混合體，同一個腫瘤病灶中的不同腫瘤細胞對抗EGFR單克隆抗體的敏感性并不完全一致，并且很可能對抗EGFR單克隆抗體耐藥性的產生具有重要作用。那么在結腸癌的治療中，攻擊單一、有限的靶標

5、（及其作用通路）是否能夠消滅復雜的腫瘤？腫瘤異質性是否限制了EGFR單克隆抗體的靶向性治療效果，誘導耐藥性的產生，目前并不清楚。
　　腫瘤微環(huán)境由腫瘤細胞、間質組織和細胞外間質構成，提供了腫瘤細胞生存、增殖的土壤。在腫瘤微環(huán)境中不同細胞間通過分泌各種細胞因子、趨化因子、細胞外基質蛋白等，進行細胞間信息傳遞。研究顯示腫瘤微環(huán)境中的成纖維細胞通過旁分泌表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子(TGF-β)、肝細胞生長因子(HGF)等，促進

6、上皮性腫瘤惡性增殖。最新研究證實，腫瘤微環(huán)境中一些特定的生長因子及細胞因子可通過抑制化療藥物誘導的腫瘤細胞凋亡而誘導耐藥。這提示抗EGFR單克隆抗體耐藥的另一個可能的機制是，腸癌細胞通過細胞間信息傳遞使敏感細胞發(fā)生耐藥。但究竟哪些耐藥信息被傳遞，如何傳遞等問題并不清楚。本研究篩選一種西妥昔單抗耐藥細胞RKO及一種相對敏感細胞Caco-2，探討結腸腫瘤細胞間是否存在信息傳遞，這種信息傳遞能否誘導敏感的腫瘤細胞產生耐藥，并對其具體機制進行了

7、深入探討。
　　材料與方法:
　　1、采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài);
　　2、采用超濾離心法制備濃縮的細胞上清;
　　3、采用MTT法檢測細胞增值能力;
　　4、采用Western blot檢測EGFR，p-EGFR，MET，p-MET，ERK，p-ERK，Akt，p-Akt，Actin蛋白的表達;
　　5、采用細胞因子抗體芯片檢測細胞上清液的生長因子;
　　6、采用ELISA法檢測細胞上清液生長

8、因子的含量;
　　7、采用RT-PCR法檢測HGF的mRNA表達水平;
　　8、統計學處理:每次實驗重復3次，數據以均值±標準差（(x)±s）表示。采用SPSS13.0統計軟件進行t檢驗、Spearman秩相關檢驗和Fisher精確計算概率法，P＜0.05有統計學意義。
　　實驗結果:
　　1、耐藥細胞RKO細胞上清可誘導敏感細胞Caco-2對西妥昔單抗產生耐藥
　　MTT法測定不同濃度西妥昔單抗處理結腸癌

9、caco-2、RKO細胞72h，結果顯示西妥昔單抗對RKO細胞無明顯抑制率（西妥昔單抗20μg/ml、作用72h時抑制率為3.33±1.70％），Caco-2細胞隨著西妥昔單抗?jié)舛鹊脑黾右种坡室搽S之增加（西妥昔單抗20μg/ml、作用72h時抑制率為29.58±5.52％）。分別用濃縮的低濃度及高濃度的RKO、caco-2細胞上清及西妥昔單抗處理caco-2細胞72h，結果顯示不同濃度的RKO細胞上清聯合西妥昔單抗處理組與西妥昔單抗單獨

10、處理組相比，細胞的生存率分別由76％升至102％和123％(P＜0.05)，而caco2上清聯合處理組無明顯變化。
　　2、耐藥細胞RKO細胞上清可誘導敏感細胞Caco-2細胞的MET、AKT、ERK活化
　　不同濃度的RKO、caco-2濃縮上清處理caco2細胞10min和1h，結果顯示，RKO細胞上清處理細胞10min后，MET是濃度依賴性的活化，1h開始下調，同時下游信號通路ERK、AKT也均有明顯活化。而對照組及c

11、aco-2細胞上清處理組則無MET活化。
　　3、耐藥細胞RKO細胞可向上清里分泌HGF
　　為了解RKO細胞向上清里分泌了什么成分，使得Caco-2細胞對西妥昔單抗產生耐藥，我們用細胞因子抗體芯片檢測caco2、RKO細胞上清中生長因子表達的差異，發(fā)現RKO細胞上清HGF的信號值為2192，而caco2細胞HGF的信號值為0。ELISA結果顯示RKO細胞向上清分泌的HGF含量為2.36ng/ml，而caco-2細胞向上清分

12、泌的HGF含量為0。RT-PCR結果顯示RKO細胞中HGF的mRNA水平顯著高于caco2細胞。
　　4、MET抑制劑PHA-665752可抑制RKO細胞上清誘導的p-MET活化，與西妥昔單抗聯用促進調亡
　　選取常用的MET抑制劑PHA-665752(簡稱PHA)，分別應用PHA、西妥昔單抗及高濃度濃縮的RKO、Caco-2細胞上清作用到Caco-2細胞。MTT結果顯示單藥西妥昔單抗處理組抑制率為72.32±3.77％，R

13、KO細胞上清聯合西妥昔單抗處理組抑制率為146.56±9.90％，caco2細胞上清聯合西妥昔單抗處理組抑制率為80.09±0.96％，PHA單藥處理組抑制率為66.83±5.19，PHA聯合西妥昔單抗處理組抑制率為59.68±3.77％，RKO細胞上清聯合西妥昔單抗級PHA處理組抑制率為90.11±6.13％。觀察PHA對活化的MET通路的影響，可見PHA即可以明顯抑制由RKO細胞上清引起的MET磷酸化，也可以明顯抑制ERK、AKT磷